[目的] 利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株，为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白EspF与宿主ANXA6蛋白相互作用及其致病机制奠定基础。[方法] 根据CRISPR/Cas9 靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA（sgRNA），基于LentiCRISPRv2载体构建LentiCRISPRv2-sgRNA重组质粒，转入293T细胞中，制备sgRNA-Cas9慢病毒，将慢病毒感染Caco-2细胞，经嘌呤霉素筛选阳性细胞，有限稀释法分离培养单克隆细胞，提取单克隆细胞基因组DNA，并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增，测序并进行脱靶效应评估；免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况，CCK8试剂盒检测细胞增殖能力，免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。[结果] Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功；脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象；基因敲除对细胞增殖能力无明显影响；免疫荧光结果显示，Caco-2及Caco-2anxa6-/-细胞紧密连接蛋白ZO-1均沿细胞膜连续分布，结构完整，转染EspF质粒后出现分布不完整、缺口等现象。[结论] 成功构建anxa6基因稳定敲除的Caco-2细胞株，初步探索ANXA6蛋白在紧密连接分布中的作用，为进一步研究大肠杆菌O157:H7通过EspF-ANXA6互作介导宿主肠屏障损伤分子机制提供技术支撑。