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摘要[目的]建立混合型强阴离子（MAX）全自动固相萃取富集净化，超高效液相色谱法快速检测食品中米酵菌酸残留量的方法。[方法]采用C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇和1%乙酸为流动相，检测波长为267 nm。[结果]米酵菌酸在0.1～40.0 mg/L线性良好，相关系数大于0.999 9。考察样品的提取条件及不同固相萃取小柱的净化效果表明，选择80%乙腈溶液（含2%氨水）为提取溶剂，超声提取30 min，MAX小柱富集净化，效果最佳。方法检出限为2.5 μg/kg，平均回收率为90.11%～96.54%，相对标准偏差为3.05%。[结论]采用自动固相萃取仪，使得前处理简单快速、重复性好，方法学验证表明该方法精确灵敏、回收率高，适用于食品中米酵菌酸残留量的快速测定。
关键词米酵菌酸；食品；超高效液相色谱；混合阴离子全自动固相萃取
中图分类号TS207文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）08-0159-02
Fast Determination of Bongkrekic Acid in Food by Auto Solid Phase Extractionultra High Performance Liquid Chromatography
ZHOU Xia，CHEN Wanqin，FU Hongxue et al（Zhejiang Institution of Food and Drug Control， Hangzhou，Zhejiang 310052）
Abstract[Objective] The research aimed to establish a mixedmode anion exchange （MAX） auto solid phase extraction （SPE） purification and ultrahigh performance liquid phase chromatography for the rapid determination of bongkrekic acid （BKA） in food.[Method]Using a C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm），with methanol and 1% acetic acid as mobile phase，the detection wavelength was 267 nm.[Result]BKA had a good linearity between the concentration range of 0.1-40.0 mg/L， the correlation coefficient was more than 0.999 9.The extraction conditions of the samples and the purification effects of different solid phase extraction cartridges showed that the optimum conditions were as follows： 80% acetonitrile solution （containing 2% ammonia） as the extraction solvent and ultrasonic extraction for 30 min， MAX column enrichment purification， the best effect.The detection limit was 2.5 μg/kg. The average recovery was 90.11% - 96.54%. The relative standard deviation was 3.05%.[Conclusion]SPE makes the pretreatment simple， rapid and reproducible. The methodological verification shows that the method is accurate，sensitive and has high recovery rate. It is suitable for the rapid determination of the acid residues in BKA in food.
Key wordsBongkrekic acid （BKA）；Food；Ultra high performance liquid chromatography；MAX auto solid phase extraction
作者簡介周霞（1990—），女，浙江仙居人，药师，硕士，从事食品分析、药物分析研究。*通讯作者，主任药师，硕士，硕士生导师，从事食品分析、药物分析研究。
收稿日期2017-12-08
米酵菌酸（Bongkrekic acid，BKA）是一种脂溶性酸性化合物，分子式为C28H38O7，相对分子质量为486.6[1]，是椰毒假单胞菌酵米面亚种代谢物中的一种[2-3]，它存在于发酵食品、变质银耳等食物中，毒性较强，食用者会出现恶心、呕吐、抽搐、休克等中毒症状，损伤肝、脑神经细胞以及肾脏组织[4-5]，在我国引起多起食物中毒事件，需严加防范。目前米酵菌酸的检测方法较少，但是近年来许多学者对米酵菌酸的生物合成及其在细胞凋亡、损伤等方面开展了研究[6-11]，并且发现米酵菌酸对细胞线粒体通透性转换孔有抑制作用。米酵菌酸的检测方法主要有液相色谱法、波层色谱法、紫外分光光度法以及液质联用法。现有方法前处理方法周期长、有机试剂消耗量大、回收率低，不适用于批量样品的检测分析。该试验基于现有米酵菌酸检测的不足，建立了混合强阴离子交换柱全自动固相萃取-液相色谱测定食品中米酵菌酸残留量的方法，以期为实验室开展相关检测提供参考依据。 1材料与方法
1.1材料与试剂玉米面、银耳等样品采集于市场。米酵菌酸标准品（纯度95%），SIGMA公司；乙酸、甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯；氨水等均为分析纯。
1.2仪器与设备Thermo U3000 （配有DAD检测器）超高效液相色谱法，美国Thermo公司；Fotector plus 全自动固相萃取仪，美国Reeko公司；Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；Multifuge X1高速冷冻离心机，美国Thermo公司；KH-500DV超声仪，昆山永创超声仪器有限公司；QT-1涡旋混合器，上海琪特分析仪器有限公司；Waters固相萃取装置，美国Waters公司；XPE205电子天平，瑞士公司。
1.3方法
1.3.1色谱条件。色谱柱为Waters SunFire C18（250 mm×4.6mm，5 μm）；流動相为甲醇-1%乙酸水（75∶25，V/V）；柱温35 ℃；波长267 nm；进样量50 μL。
1.3.2样品前处理。
干试样经粉碎后，称取20 g（精确至0.01 g）置于锥形瓶中，加入40 mL 80%乙腈水溶液（含2%氨水），混匀，室温下避光浸泡1 h，置于超声波振荡器中超声提取约30 min ，低速离心。转移上清液，在残渣中加入40 mL甲醇溶液（含 2%氨水），重复上述操作一次，合并上清液，待净化。采用全自动固相萃取仪进行程序洗脱，使用Waters Oasis MAX 6cc（500 mg）阴离子交换柱[12]，富集洗脱程序时间如表1所示，对80 mL提取溶液进行净化富集。
经全自动固相萃取仪富集净化，对洗脱液进行收集，于40 ℃水浴中氮吹至干，然后加入1.0 mL甲醇，涡旋溶解，混匀，经微孔有机滤膜过滤后进行HPLC分析。
2结果与分析
2.1提取溶剂优化
米酵菌酸是一种脂溶性的极性化合物，该试验探索了不同比例的乙腈溶液和甲醇溶液对米酵菌酸提取效率的影响。样品经不同溶剂提取后，取离心后上清液氮吹浓缩后，过MAX固相萃取柱净化后，浓缩上机分析。结果发现，80%乙腈水溶液的提取效果最佳，而且100%甲醇或乙腈的过柱效率低，耗时长。因为米酵菌酸分子结构中含有3个羧基，在碱性环境下能够解离出氢离子而带一部分负电荷，易溶于有机溶剂中，在80%乙腈水溶液中加入一定量的氨水，可以提高过柱的效率。该试验选择体积分数为80%的乙腈水溶液（含2%氨水）作为提取液。
2.2超声时间优化
超声提取具有提取效率高、时间短、操作简单等优点[1]，已成为近年来应用最广泛的食品提取方式之一。该试验考察了超声提取时间对米酵菌酸提取效率的影响，发现30 min时提取效果最佳，与文献[1]中报道一致。
2.3固相萃取柱优化
选择C18、Prime柱及MAX等固相萃取小柱进行。样品经优化后的溶液超声提取、离心后等到上清液，分别经C18、Prime、WAX及MAX固相萃取小柱净化，结果发现，C18、Prime柱对该溶液提取下的米酵菌酸并无保留。WAX的使用方法是先用酸化的试剂进行清洗后再用碱化试剂洗脱，“2.1”研究发现在提取实际中加入一定量的碱性物质氨水有利于提高提取效率，故不采用WAX固相萃取柱。米酵菌酸为酸性化合物，可与MAX柱进行离子交换而被保留，从而起到了富集净化的目的，最后由酸性溶液将目标化合物洗脱。
2.4流动相优化
因为米酵菌酸的酸性较强，流动相的pH对其保留行为影响较大，当流动相条件为酸性时可避免离子化，从而得到良好峰形。该试验考察不同比例甲酸、乙酸对保留行为的影响发现，当使用甲酸作为流动相时，出峰较乙酸靠后，存在一定的峰展宽。考察不同比例的乙酸溶液发现，随着乙酸浓度的升高，柱效提高，考虑到柱子的耐受性，选择1%乙酸水溶液和甲醇作为流动相。
2.5方法回收率及精密度试验结果
按照“1.3.2”项下的前处理方法，选择不含米酵菌酸的玉米面和银耳进行6个水平的加标回收率试验，每个水平进行6个平行测定。从表2可看出，2种样品平均加标回收率在90.11%～96.54%，相对标准偏差小于3.05%。该方法学验证说明该方法适用于食品中米酵菌酸的含量测定，检出限（S/N≥3）为0.002 5 mg/kg。米酵菌酸在0.1～40.0 mg/L 线性良好，相关系数r值大于0.999 9。
3结论
该试验建立了基于混合型强阴离子全自动固相萃取-超高效液相色谱快速测定食品中米酵菌酸含量的方法。采用了全自动固相萃取仪代替了传统的人工过柱的方法[13]，实现了自动化，减少了人力成本，减少了人为误差，实现了固相萃取流速的可控性，提高了试验的重复性和准确性，缩短了样品处理周期，该方法对提取条件、色谱条件等进行了优化，得到了良好的分离度和色谱峰，灵敏度高，回收率高，前处理周期较短，满足了食品中米酵菌酸含量的检测要求，为实验室开展相关检测提供参考依据，为保障食品安全发挥积极作用。
参考文献
[1]
李红艳，金燕飞，黄海智，等.高效液相色谱-二极管阵列检测器结合固相萃取法快速测定食品中米酵菌酸残留[J].食品科学，2016，37（24）：247-251.
[2] 苏肯明，梁达清.液相色谱-串联质谱法测定银耳中的米酵菌酸[J].广东化工，2014，41（16）：168-169.
[3] 周鹏.超高效液相色谱串联质谱法测定银耳中米酵菌酸[J].食品研究与开发，2015，36（22）：123-126.
[4] 宋兴田，吴洪娟，庄宝祥.米酵菌酸中毒小鼠肝和脑组织的形态学改变[J].中国医药导报，2010，7（26）：36-38.
[5] 宋兴田，吴洪娟，庄宝祥，等.米酵菌酸对小鼠肾组织毒性作用的超微结构观察[J].中国医学创新，2010，7（24）：145-146.
[6] OKUDA K，HASUI K，ABE M，et al.Molecular design， synthesis， and evaluation of novel potent apoptosis inhibitors inspired frombongkrekic acid[J].Chemical research in toxicology，2012，25（10）：2253-2260.
关键词米酵菌酸；食品；超高效液相色谱；混合阴离子全自动固相萃取
中图分类号TS207文献标识码
A文章编号0517-6611（2018）08-0159-02
Fast Determination of Bongkrekic Acid in Food by Auto Solid Phase Extractionultra High Performance Liquid Chromatography
ZHOU Xia，CHEN Wanqin，FU Hongxue et al（Zhejiang Institution of Food and Drug Control， Hangzhou，Zhejiang 310052）
Abstract[Objective] The research aimed to establish a mixedmode anion exchange （MAX） auto solid phase extraction （SPE） purification and ultrahigh performance liquid phase chromatography for the rapid determination of bongkrekic acid （BKA） in food.[Method]Using a C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm），with methanol and 1% acetic acid as mobile phase，the detection wavelength was 267 nm.[Result]BKA had a good linearity between the concentration range of 0.1-40.0 mg/L， the correlation coefficient was more than 0.999 9.The extraction conditions of the samples and the purification effects of different solid phase extraction cartridges showed that the optimum conditions were as follows： 80% acetonitrile solution （containing 2% ammonia） as the extraction solvent and ultrasonic extraction for 30 min， MAX column enrichment purification， the best effect.The detection limit was 2.5 μg/kg. The average recovery was 90.11% - 96.54%. The relative standard deviation was 3.05%.[Conclusion]SPE makes the pretreatment simple， rapid and reproducible. The methodological verification shows that the method is accurate，sensitive and has high recovery rate. It is suitable for the rapid determination of the acid residues in BKA in food.
Key wordsBongkrekic acid （BKA）；Food；Ultra high performance liquid chromatography；MAX auto solid phase extraction
作者簡介周霞（1990—），女，浙江仙居人，药师，硕士，从事食品分析、药物分析研究。*通讯作者，主任药师，硕士，硕士生导师，从事食品分析、药物分析研究。
收稿日期2017-12-08
米酵菌酸（Bongkrekic acid，BKA）是一种脂溶性酸性化合物，分子式为C28H38O7，相对分子质量为486.6[1]，是椰毒假单胞菌酵米面亚种代谢物中的一种[2-3]，它存在于发酵食品、变质银耳等食物中，毒性较强，食用者会出现恶心、呕吐、抽搐、休克等中毒症状，损伤肝、脑神经细胞以及肾脏组织[4-5]，在我国引起多起食物中毒事件，需严加防范。目前米酵菌酸的检测方法较少，但是近年来许多学者对米酵菌酸的生物合成及其在细胞凋亡、损伤等方面开展了研究[6-11]，并且发现米酵菌酸对细胞线粒体通透性转换孔有抑制作用。米酵菌酸的检测方法主要有液相色谱法、波层色谱法、紫外分光光度法以及液质联用法。现有方法前处理方法周期长、有机试剂消耗量大、回收率低，不适用于批量样品的检测分析。该试验基于现有米酵菌酸检测的不足，建立了混合强阴离子交换柱全自动固相萃取-液相色谱测定食品中米酵菌酸残留量的方法，以期为实验室开展相关检测提供参考依据。 1材料与方法
1.1材料与试剂玉米面、银耳等样品采集于市场。米酵菌酸标准品（纯度95%），SIGMA公司；乙酸、甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯；氨水等均为分析纯。
1.2仪器与设备Thermo U3000 （配有DAD检测器）超高效液相色谱法，美国Thermo公司；Fotector plus 全自动固相萃取仪，美国Reeko公司；Milli-Q超纯水器，美国Millipore公司；Multifuge X1高速冷冻离心机，美国Thermo公司；KH-500DV超声仪，昆山永创超声仪器有限公司；QT-1涡旋混合器，上海琪特分析仪器有限公司；Waters固相萃取装置，美国Waters公司；XPE205电子天平，瑞士公司。
1.3方法
1.3.1色谱条件。色谱柱为Waters SunFire C18（250 mm×4.6mm，5 μm）；流動相为甲醇-1%乙酸水（75∶25，V/V）；柱温35 ℃；波长267 nm；进样量50 μL。
1.3.2样品前处理。
干试样经粉碎后，称取20 g（精确至0.01 g）置于锥形瓶中，加入40 mL 80%乙腈水溶液（含2%氨水），混匀，室温下避光浸泡1 h，置于超声波振荡器中超声提取约30 min ，低速离心。转移上清液，在残渣中加入40 mL甲醇溶液（含 2%氨水），重复上述操作一次，合并上清液，待净化。采用全自动固相萃取仪进行程序洗脱，使用Waters Oasis MAX 6cc（500 mg）阴离子交换柱[12]，富集洗脱程序时间如表1所示，对80 mL提取溶液进行净化富集。
经全自动固相萃取仪富集净化，对洗脱液进行收集，于40 ℃水浴中氮吹至干，然后加入1.0 mL甲醇，涡旋溶解，混匀，经微孔有机滤膜过滤后进行HPLC分析。
2结果与分析
2.1提取溶剂优化
米酵菌酸是一种脂溶性的极性化合物，该试验探索了不同比例的乙腈溶液和甲醇溶液对米酵菌酸提取效率的影响。样品经不同溶剂提取后，取离心后上清液氮吹浓缩后，过MAX固相萃取柱净化后，浓缩上机分析。结果发现，80%乙腈水溶液的提取效果最佳，而且100%甲醇或乙腈的过柱效率低，耗时长。因为米酵菌酸分子结构中含有3个羧基，在碱性环境下能够解离出氢离子而带一部分负电荷，易溶于有机溶剂中，在80%乙腈水溶液中加入一定量的氨水，可以提高过柱的效率。该试验选择体积分数为80%的乙腈水溶液（含2%氨水）作为提取液。
2.2超声时间优化
超声提取具有提取效率高、时间短、操作简单等优点[1]，已成为近年来应用最广泛的食品提取方式之一。该试验考察了超声提取时间对米酵菌酸提取效率的影响，发现30 min时提取效果最佳，与文献[1]中报道一致。
2.3固相萃取柱优化
选择C18、Prime柱及MAX等固相萃取小柱进行。样品经优化后的溶液超声提取、离心后等到上清液，分别经C18、Prime、WAX及MAX固相萃取小柱净化，结果发现，C18、Prime柱对该溶液提取下的米酵菌酸并无保留。WAX的使用方法是先用酸化的试剂进行清洗后再用碱化试剂洗脱，“2.1”研究发现在提取实际中加入一定量的碱性物质氨水有利于提高提取效率，故不采用WAX固相萃取柱。米酵菌酸为酸性化合物，可与MAX柱进行离子交换而被保留，从而起到了富集净化的目的，最后由酸性溶液将目标化合物洗脱。
2.4流动相优化
因为米酵菌酸的酸性较强，流动相的pH对其保留行为影响较大，当流动相条件为酸性时可避免离子化，从而得到良好峰形。该试验考察不同比例甲酸、乙酸对保留行为的影响发现，当使用甲酸作为流动相时，出峰较乙酸靠后，存在一定的峰展宽。考察不同比例的乙酸溶液发现，随着乙酸浓度的升高，柱效提高，考虑到柱子的耐受性，选择1%乙酸水溶液和甲醇作为流动相。
2.5方法回收率及精密度试验结果
按照“1.3.2”项下的前处理方法，选择不含米酵菌酸的玉米面和银耳进行6个水平的加标回收率试验，每个水平进行6个平行测定。从表2可看出，2种样品平均加标回收率在90.11%～96.54%，相对标准偏差小于3.05%。该方法学验证说明该方法适用于食品中米酵菌酸的含量测定，检出限（S/N≥3）为0.002 5 mg/kg。米酵菌酸在0.1～40.0 mg/L 线性良好，相关系数r值大于0.999 9。
3结论
该试验建立了基于混合型强阴离子全自动固相萃取-超高效液相色谱快速测定食品中米酵菌酸含量的方法。采用了全自动固相萃取仪代替了传统的人工过柱的方法[13]，实现了自动化，减少了人力成本，减少了人为误差，实现了固相萃取流速的可控性，提高了试验的重复性和准确性，缩短了样品处理周期，该方法对提取条件、色谱条件等进行了优化，得到了良好的分离度和色谱峰，灵敏度高，回收率高，前处理周期较短，满足了食品中米酵菌酸含量的检测要求，为实验室开展相关检测提供参考依据，为保障食品安全发挥积极作用。
参考文献
[1]
李红艳，金燕飞，黄海智，等.高效液相色谱-二极管阵列检测器结合固相萃取法快速测定食品中米酵菌酸残留[J].食品科学，2016，37（24）：247-251.
[2] 苏肯明，梁达清.液相色谱-串联质谱法测定银耳中的米酵菌酸[J].广东化工，2014，41（16）：168-169.
[3] 周鹏.超高效液相色谱串联质谱法测定银耳中米酵菌酸[J].食品研究与开发，2015，36（22）：123-126.
[4] 宋兴田，吴洪娟，庄宝祥.米酵菌酸中毒小鼠肝和脑组织的形态学改变[J].中国医药导报，2010，7（26）：36-38.
[5] 宋兴田，吴洪娟，庄宝祥，等.米酵菌酸对小鼠肾组织毒性作用的超微结构观察[J].中国医学创新，2010，7（24）：145-146.
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