【摘 要】
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目的 改良真菌基因组DNA的提取方法,建立真菌通用聚合酶链反应(PCR),为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具.方法 参考前人报道的多种真菌基因组DNA的提取方
【机 构】
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上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科,上海市闵行区中心医院检验科
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目的 改良真菌基因组DNA的提取方法,建立真菌通用聚合酶链反应(PCR),为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具.方法 参考前人报道的多种真菌基因组DNA的提取方法,作改良以确立本研究中所采纳的手段,并应用真菌核糖体DNA(rDNA)通用引物,以实验室保存的标准菌株及临床分离菌株来建立临床真菌感染检测用通用PCR.结果 白念珠菌和烟曲霉在75℃温度下分别作用60和80 min可以完全破灭活.经目前多种破壁方法的探讨,发现对于白念珠菌(单细胞真菌)选用酶消化法,破壁效率高达98.29％,而烟曲霉(多细胞真菌)则需要酶消化法与打击器振荡法联合应用,其破壁率也可达66.68％,进一步用酚氯仿法抽提其基因组DNA,能够获得相对纯度高且有一定得量.当选择真菌rDNAITS2区间的一对通用引物,通过PCR反应体系的优化,使得本研究中建立的通用PCR,对于白念珠菌和烟曲霉的检测下限分别为5个和9.7个,其PCR产物测序结果与数据库比对完全一致,同时选择临床分离的或实验室保存的其他真菌、细菌和病毒株进行验证,该方法仅针对真菌群,结合测序分析可以实现种属水平的鉴定.结论 改良真菌基因组DNA提取后所建立的针对真菌rDNA的通用PCR敏感且特异,适宜实验室操作.
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