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【摘要】 目的:探讨应用实时荧光定量PCR技术检测丙型肝炎患者血清抗-HCV及患者血清HCV-DNA。方法:选取我院2009年1月至2010年10月检查丙型肝炎患者92例，ELISA法测定血清抗-HCV水平，实时荧光定量监测患者血清HCV-DNA水平。结果 收治92例丙型肝炎检查患者，ELISA法检测，抗-HCV阳性64例，抗-HCV阴性28例。RT-PCR测定64例抗-HCV阳性患者中HCV-RNA阳性57例，检出率为89.02%，28例抗-HCV阴性患者中HCV-RNA阳性2例，检出率为7.14%。结论 实时荧光定量PCR检测血清HCV-DNA较ELISA法测定血清抗-HCV更为直接、更为准确，样本检测重复性好。
【关键词】：PCR技术；丙型肝炎；HCV-DNA
【中图分类号】R543【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)03-0291-01
丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链DNA，呈RNA-RNA复制病毒，是一种嗜肝性慢性病毒，对其他组织和器官也存在广泛的嗜性，可造成肝外感染，HCV感染干扰外周血单核细胞正常代谢，影响功能表达，影响丙型肝炎患者预后[1]。患者感染后发病与临床症状不典型，易发展为肝硬化或肝癌。以往临床诊断丙型肝炎以抗-HCV检测为主，但丙肝患者血清中出现抗-HCV较晚、甚至不出现，临床仅进行血清学指标的诊断易漏诊，而且还不能检出所有HCV携带者。HCV-RNA是HCV活跃复制的可靠指标，患者感染初期，1~2周内血清中即可检测到。检测血清HCV-RNA水平对于早期诊断和临床治疗以及预后有着非常重要的临床指导意义。选择前来我院2009年1月至2010年10月检查丙型肝炎患者92例，采用实时荧光PCR技术患者血清HCV-RNA水平，探讨实时荧光PCR检测血清HCV-RNA的特异性和敏感性。
1 临床资料
1.1一般资料:选取我院2009年1月至2010年10月门诊及住院检查丙型肝炎患者92例，男63例，女29例，年龄19~66岁，平均年龄41.3岁。
1.2样本采集和测定:采集患者空腹静脉血，3000r/min，离心20min，分离血清置于EP管内，-70℃待检。采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书测定血清抗抗-HCV水平，做好检测质量控制，保重结果准确性。采用RT-PCR法测定血清HCV-RNA水平。根据Trizol试剂说明书提取HCV-RNA的提取按进行[2]。采用北京中衫金桥生物技术有限公司HCV-RNA (PCR)荧光检测试剂盒，实验操作步骤严格按说明书进行。
依据HCVs 基因序列，设计引物为5'-GGCCAGATTACCGGCCACCG-3', 5'-AAGCTCGACAAGGTAGAACC-3'。DEPC處理水9μl，dNTP1μl，Oligo-dT1μl，RNA1μl，引物1μl，探针1μl，混匀，75℃反应5min，42℃加入逆转录反应液，混匀，转录60min后加入PCR反应管。95℃、5min、39循环；94℃、1min，55℃、1min；72℃、1min; 72℃、7min。健康人血清HCV-RNA水平为阳性对照，对ddH2O为空白对照。
1.4 结果处理:采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，其中计量资料采用t检验或秩和检验进行分析，计数资料应用χ2检验，相关性采用秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
收治92例丙型肝炎检查患者，ELISA法检测，抗-HCV阳性64例，抗-HCV阴性28例。RT-PCR测定64例抗-HCV阳性患者中HCV-RNA阳性57例，检出率为89.02%，28例抗-HCV阴性患者中HCV-RNA阳性2例，检出率为7.14%。详细结果见表1。
3 讨论
抗-HCV检测丙型病毒性肝炎具有一定的特异性和灵敏性，但其结果尚不能作为确诊HCV现症感染的依据，抗-HCV不能检测出所有HCV携带者。随着病毒检测由细胞水平至分子水平后，HCV-RNA更为直接反映血清中HCV的存在。抗-HCV可以反应HCV感染及机体感染后产生的特异免疫应答。但HCV感染后产生多种抗体，就会出现本研究中出现漏检和假阳性。本研究中ELISA法检测到抗-HCV阳性64，而HCV-RNA阳性则为57例，原因可能是由于RT-PCR可以检测到病毒的变异，而且PCR扩增探针标记后，更增强了检测的特异性，这样就有效预防假阳性结果的出现。HCV-RNA则体现了HCV感染的特异性和灵敏性。本研究结果表明，抗-HCV阴性28例中，有2例HCV-RNA阳性，出现的原因可能由于患者机体内抗-HCV水平较低，而感染HCV后又会存在一个较长时间的潜伏期，所以患者抗-HCV呈阴性[3]。多数HCV病毒感染患者体内都会出现抗-HCV阳性表达，部分患者则感染后抗-HCV表达低。通过研究进一步表明RT-PCR检测HCV-RNA较ELISA法测定血清抗-HCV更为直接、更为准确，样本检测重复性好。
参考文献
[1]王耀宗．正视我国内型肝炎的严重性[J]．中华传染病杂志，2003，21(1): 211-213
[2] 吴国桥，茹兴龙．血液制品抗HCV酶免疫检测方法探讨[J]．浙江实用医学，2005，10(3)：216-217
[3] 陈朝霞，闵保华，陈延平．影响HCV-RNA 荧光定量PCR检测的因素及其对策[J]．国际检验医学杂志，2007(2)：85-86
作者单位：442000 湖北医药学院附属人民医院
【关键词】：PCR技术；丙型肝炎；HCV-DNA
【中图分类号】R543【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)03-0291-01
丙型肝炎病毒(HCV)为单股正链DNA，呈RNA-RNA复制病毒，是一种嗜肝性慢性病毒，对其他组织和器官也存在广泛的嗜性，可造成肝外感染，HCV感染干扰外周血单核细胞正常代谢，影响功能表达，影响丙型肝炎患者预后[1]。患者感染后发病与临床症状不典型，易发展为肝硬化或肝癌。以往临床诊断丙型肝炎以抗-HCV检测为主，但丙肝患者血清中出现抗-HCV较晚、甚至不出现，临床仅进行血清学指标的诊断易漏诊，而且还不能检出所有HCV携带者。HCV-RNA是HCV活跃复制的可靠指标，患者感染初期，1~2周内血清中即可检测到。检测血清HCV-RNA水平对于早期诊断和临床治疗以及预后有着非常重要的临床指导意义。选择前来我院2009年1月至2010年10月检查丙型肝炎患者92例，采用实时荧光PCR技术患者血清HCV-RNA水平，探讨实时荧光PCR检测血清HCV-RNA的特异性和敏感性。
1 临床资料
1.1一般资料:选取我院2009年1月至2010年10月门诊及住院检查丙型肝炎患者92例，男63例，女29例，年龄19~66岁，平均年龄41.3岁。
1.2样本采集和测定:采集患者空腹静脉血，3000r/min，离心20min，分离血清置于EP管内，-70℃待检。采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书测定血清抗抗-HCV水平，做好检测质量控制，保重结果准确性。采用RT-PCR法测定血清HCV-RNA水平。根据Trizol试剂说明书提取HCV-RNA的提取按进行[2]。采用北京中衫金桥生物技术有限公司HCV-RNA (PCR)荧光检测试剂盒，实验操作步骤严格按说明书进行。
依据HCVs 基因序列，设计引物为5'-GGCCAGATTACCGGCCACCG-3', 5'-AAGCTCGACAAGGTAGAACC-3'。DEPC處理水9μl，dNTP1μl，Oligo-dT1μl，RNA1μl，引物1μl，探针1μl，混匀，75℃反应5min，42℃加入逆转录反应液，混匀，转录60min后加入PCR反应管。95℃、5min、39循环；94℃、1min，55℃、1min；72℃、1min; 72℃、7min。健康人血清HCV-RNA水平为阳性对照，对ddH2O为空白对照。
1.4 结果处理:采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，其中计量资料采用t检验或秩和检验进行分析，计数资料应用χ2检验，相关性采用秩相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
收治92例丙型肝炎检查患者，ELISA法检测，抗-HCV阳性64例，抗-HCV阴性28例。RT-PCR测定64例抗-HCV阳性患者中HCV-RNA阳性57例，检出率为89.02%，28例抗-HCV阴性患者中HCV-RNA阳性2例，检出率为7.14%。详细结果见表1。
3 讨论
抗-HCV检测丙型病毒性肝炎具有一定的特异性和灵敏性，但其结果尚不能作为确诊HCV现症感染的依据，抗-HCV不能检测出所有HCV携带者。随着病毒检测由细胞水平至分子水平后，HCV-RNA更为直接反映血清中HCV的存在。抗-HCV可以反应HCV感染及机体感染后产生的特异免疫应答。但HCV感染后产生多种抗体，就会出现本研究中出现漏检和假阳性。本研究中ELISA法检测到抗-HCV阳性64，而HCV-RNA阳性则为57例，原因可能是由于RT-PCR可以检测到病毒的变异，而且PCR扩增探针标记后，更增强了检测的特异性，这样就有效预防假阳性结果的出现。HCV-RNA则体现了HCV感染的特异性和灵敏性。本研究结果表明，抗-HCV阴性28例中，有2例HCV-RNA阳性，出现的原因可能由于患者机体内抗-HCV水平较低，而感染HCV后又会存在一个较长时间的潜伏期，所以患者抗-HCV呈阴性[3]。多数HCV病毒感染患者体内都会出现抗-HCV阳性表达，部分患者则感染后抗-HCV表达低。通过研究进一步表明RT-PCR检测HCV-RNA较ELISA法测定血清抗-HCV更为直接、更为准确，样本检测重复性好。
参考文献
[1]王耀宗．正视我国内型肝炎的严重性[J]．中华传染病杂志，2003，21(1): 211-213
[2] 吴国桥，茹兴龙．血液制品抗HCV酶免疫检测方法探讨[J]．浙江实用医学，2005，10(3)：216-217
[3] 陈朝霞，闵保华，陈延平．影响HCV-RNA 荧光定量PCR检测的因素及其对策[J]．国际检验医学杂志，2007(2)：85-86
作者单位：442000 湖北医药学院附属人民医院