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摘 要： 应用纳米金免疫层析技术（双抗夹心法）和柠檬酸三钠还原法建立一种对尿RBP的快速定量检测方法，并在此基础上研制出快速检测试纸条。该试纸条用纳米金免疫层析定量分析仪可在15 min内实现RBP定量检测，检测限为150 μg/L（相当于150 ng/mL），检测范围为150～5000 μg/L。与尿微量白蛋白（ALB）、转铁蛋白（TRF）、β2-微球蛋白（β2-MG）、尿纤维连接蛋白（FN）、溶菌酶（LZM）等肾脏疾病标志物无交叉反应。该方法特异性强、检测灵敏度高、范围广、简便快捷，在近端肾小管的损伤、糖尿病肾病等肾脏疾病的早期诊断及过程监控中具有较为广泛的临床应用。
关键词： 尿RBP； 纳米金； 免疫层析； 定量检测
中图分类号： O 648 文献标识码： A 文章编号： 1000-5137（2013）02-0154-07
0 前 言
视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein，RBP）是体内一类将VitA从肝脏中转运至靶组织以及实现VitA细胞内转运代谢的特异性运载蛋白，在协助VitA发挥生理功能中起着不可替代的作用[1]。研究发现RBP广泛存在于正常人的体液中，属于α1-球蛋白[2]。RBP主要以视黄醇和前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，复合物中的视黄醇结合蛋白便与前白蛋白分离而从肾小球滤出，并由近端肾小管上皮细胞吸收、降解[3]。近年来的深入研究表明，RBP含量的改变能够敏感地反映近端肾小管的损伤，实现糖尿病、肾病的早期诊断[4]。
彭彦孟等[5]在采用ELISA法对241例肾脏疾病患者的尿RBP进行检测以探讨尿RBP在早期肾小管损伤的诊断价值。实验发现，肾损伤患者的尿RBP较正常对照组明显增高；同时，尿RBP在酸性环境中稳定性好且不易被破坏，是反映肾小管受损的敏感指标。王瑞石等[6]在对4种经肾穿刺活检诊断的肾病患者进行尿RBP的变化与肾小管间质形态学改变之间的关系，以及肾功能对其影响的研究中指出，尿RBP与肾小管间质的形态学改变有良好的相关性，其水平高低直接反应肾小管间质的病变程度。因此，尿RBP是反映近端肾小管功能的特异性标志物，可能对鉴别诊断各种肾脏疾病小管间质病理受损及受损程度具有重要临床意义。
纳米金免疫层析技术 （GICA） [7-8]是20世纪90年代以来发展起来的一种将纳米生物技术、色谱层析技术和免疫层析技术相结合的固相膜免疫层析方法，并在此基础上发展成的一种新型体外诊断技术[9]。虽然近年来该方法发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但采用该方法实现对RBP的定量检测仍未见报道。
目前临床上对RBP的定量检测已经成为肾功能检测的一种有效且成熟的方法，而ELISA法和免疫比浊法是各大医院目前普遍采用的方法。但这两种方法耗时长、操作步骤比较繁琐、对操作人员的专业技术要求较高、所需仪器也较为昂贵等，这给基层医院对RBP定量检测的普及造成了不小困难。而本研究采用纳米金免疫层析技术，正好在弥补传统方法的缺陷与不足的同时，还能实现对尿RBP的定量检测，对近端肾小管的损伤、糖尿病肾病等肾脏类疾病的大规模筛查、早期诊断及过程监控都具有重要影响。
1 材 料
1。1 主要仪器
H01-1B数显恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Thermo MμLtiskan Spectrμm 多功能酶标仪（Thermo Scientific）；扫描电子显微镜SEM （JEM-2010，JEOL，Japan）；AllegraTM 64R 台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；涡旋仪（上海医科大学设备厂）；激光Nano Zetasizer电位及粒径测定仪（Malvern公司）；HM3010单维往复式划膜仪，ZQ-2000微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）；DH-252BS除湿机（杭州川井电器有限公司）；BN-Q2000型纳米金免疫层析定量分析仪（上海柏纳生物技术有限公司）；真空干燥箱（上海精密仪器仪表有限公司）；纯水仪（上海力康公司）。
1。2 主要试剂
鼠抗RBP单克隆抗体（S-64-11）、（S-113-7）（上海中科英沐生物科技有限公司）；RBP标准品（北京西美杰生物有限公司）；二抗（上海捷宁生物科技有限公司）；小牛血清白蛋白（Sigma公司）；氯金酸（上海精细化工研究所）；无水碳酸钾（国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸三钠（上海青析化工有限公司）；氯化钠（上海文旻生化科技有限公司）；蔗糖（AMRESCO公司）；双蒸水（自来水由纯水仪制得）；硝酸纤维素膜（NC膜）（美国Millipore公司）；玻璃纤维膜8964（Ahlstorm公司）；PVC塑料底板、吸水纸（上海金标生物科技有限公司）。
2 试纸条的制备
2。1 纳米金的制备
采用柠檬酸三钠还原法[10-11]制备20 nm纳米金。向经酸洗净并干燥过的锥形瓶中加入99 mL双蒸水，再加入1%氯金酸溶液1 mL。将锥形瓶置于数显恒温磁力搅拌器上加热至沸腾，沸腾后在剧烈的搅拌下一次性迅速准确地加入新鲜配制的1%柠檬酸三钠溶液2 mL，当溶液完全变为透明的酒红色时，继续煮沸15 min，即制得所需的纳米金，常温下继续搅拌冷却至室温，4 ℃储存待用。
2。2 纳米金标记抗体条件选择及标记
2。2。1 最适pH值的确定
分别取1 mL纳米金溶液用0。1 mol/L碳酸钾溶液调节pH值至6。0、7。0、8。0、9。0、10。0。各取不同pH的纳米金溶液200 μL至5支EP管中，再加入4 μg鼠抗RBP单克隆抗体（S-113-7），混合均匀，室温反应10 min后，向其中加入40 μL 10%氯化钠溶液，静置2 h，观察各管颜色变化。 [12] 赫丽娜，刘帅，孙瑾。纳米金溶胶的制备与应用研究[J]。科技信息，2009，13（2）：30-31。
Gold nanoparticle immunochromatographic assay for
quantitative detection of urinary RBP
XU Kuan， SHEN Hebai， ZHU Longzhang*
（College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234， China）
Abstract： A rapid quantitative detection of urinary RBP was established by using nano-gold immunochromatography （sandwich method） and trisodium citrate reduction method and a rapid immunochromatographic test strip was developed。 Theimmunochromatographic test strip can quantitatively detect RBP within 15 minutes。 The detection limit was 150ng/mL and detection range was from 150 to 5000 ng/mL。 There were no cross-reactions with others kidney disease markers，such as urinary albumin （ALB），transferrin protein （TRF），β2-microglobulin （β2-MG），urinary fiber connecting protein （FN），and lysozyme （LZM）。 The results indicate that it is a quick and simple method with strong specificity，high sensitivity，and wide detection range。 The rapid detection method will have extensive clinical applications in the early diagnosis of proximal tubular damage，kidney disease，diabetic nephropathy，and process monitoring。
Key words： Urinary RBP； nano-gold； immunochromatographic assay； quantitative detection
（责任编辑：郁 慧）
关键词： 尿RBP； 纳米金； 免疫层析； 定量检测
中图分类号： O 648 文献标识码： A 文章编号： 1000-5137（2013）02-0154-07
0 前 言
视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein，RBP）是体内一类将VitA从肝脏中转运至靶组织以及实现VitA细胞内转运代谢的特异性运载蛋白，在协助VitA发挥生理功能中起着不可替代的作用[1]。研究发现RBP广泛存在于正常人的体液中，属于α1-球蛋白[2]。RBP主要以视黄醇和前白蛋白结合的复合物形式存在，当复合物中视黄醇与靶细胞结合后，复合物中的视黄醇结合蛋白便与前白蛋白分离而从肾小球滤出，并由近端肾小管上皮细胞吸收、降解[3]。近年来的深入研究表明，RBP含量的改变能够敏感地反映近端肾小管的损伤，实现糖尿病、肾病的早期诊断[4]。
彭彦孟等[5]在采用ELISA法对241例肾脏疾病患者的尿RBP进行检测以探讨尿RBP在早期肾小管损伤的诊断价值。实验发现，肾损伤患者的尿RBP较正常对照组明显增高；同时，尿RBP在酸性环境中稳定性好且不易被破坏，是反映肾小管受损的敏感指标。王瑞石等[6]在对4种经肾穿刺活检诊断的肾病患者进行尿RBP的变化与肾小管间质形态学改变之间的关系，以及肾功能对其影响的研究中指出，尿RBP与肾小管间质的形态学改变有良好的相关性，其水平高低直接反应肾小管间质的病变程度。因此，尿RBP是反映近端肾小管功能的特异性标志物，可能对鉴别诊断各种肾脏疾病小管间质病理受损及受损程度具有重要临床意义。
纳米金免疫层析技术 （GICA） [7-8]是20世纪90年代以来发展起来的一种将纳米生物技术、色谱层析技术和免疫层析技术相结合的固相膜免疫层析方法，并在此基础上发展成的一种新型体外诊断技术[9]。虽然近年来该方法发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用，但采用该方法实现对RBP的定量检测仍未见报道。
目前临床上对RBP的定量检测已经成为肾功能检测的一种有效且成熟的方法，而ELISA法和免疫比浊法是各大医院目前普遍采用的方法。但这两种方法耗时长、操作步骤比较繁琐、对操作人员的专业技术要求较高、所需仪器也较为昂贵等，这给基层医院对RBP定量检测的普及造成了不小困难。而本研究采用纳米金免疫层析技术，正好在弥补传统方法的缺陷与不足的同时，还能实现对尿RBP的定量检测，对近端肾小管的损伤、糖尿病肾病等肾脏类疾病的大规模筛查、早期诊断及过程监控都具有重要影响。
1 材 料
1。1 主要仪器
H01-1B数显恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Thermo MμLtiskan Spectrμm 多功能酶标仪（Thermo Scientific）；扫描电子显微镜SEM （JEM-2010，JEOL，Japan）；AllegraTM 64R 台式高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）；涡旋仪（上海医科大学设备厂）；激光Nano Zetasizer电位及粒径测定仪（Malvern公司）；HM3010单维往复式划膜仪，ZQ-2000微电脑自动斩切机（上海金标生物科技有限公司）；DH-252BS除湿机（杭州川井电器有限公司）；BN-Q2000型纳米金免疫层析定量分析仪（上海柏纳生物技术有限公司）；真空干燥箱（上海精密仪器仪表有限公司）；纯水仪（上海力康公司）。
1。2 主要试剂
鼠抗RBP单克隆抗体（S-64-11）、（S-113-7）（上海中科英沐生物科技有限公司）；RBP标准品（北京西美杰生物有限公司）；二抗（上海捷宁生物科技有限公司）；小牛血清白蛋白（Sigma公司）；氯金酸（上海精细化工研究所）；无水碳酸钾（国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸三钠（上海青析化工有限公司）；氯化钠（上海文旻生化科技有限公司）；蔗糖（AMRESCO公司）；双蒸水（自来水由纯水仪制得）；硝酸纤维素膜（NC膜）（美国Millipore公司）；玻璃纤维膜8964（Ahlstorm公司）；PVC塑料底板、吸水纸（上海金标生物科技有限公司）。
2 试纸条的制备
2。1 纳米金的制备
采用柠檬酸三钠还原法[10-11]制备20 nm纳米金。向经酸洗净并干燥过的锥形瓶中加入99 mL双蒸水，再加入1%氯金酸溶液1 mL。将锥形瓶置于数显恒温磁力搅拌器上加热至沸腾，沸腾后在剧烈的搅拌下一次性迅速准确地加入新鲜配制的1%柠檬酸三钠溶液2 mL，当溶液完全变为透明的酒红色时，继续煮沸15 min，即制得所需的纳米金，常温下继续搅拌冷却至室温，4 ℃储存待用。
2。2 纳米金标记抗体条件选择及标记
2。2。1 最适pH值的确定
分别取1 mL纳米金溶液用0。1 mol/L碳酸钾溶液调节pH值至6。0、7。0、8。0、9。0、10。0。各取不同pH的纳米金溶液200 μL至5支EP管中，再加入4 μg鼠抗RBP单克隆抗体（S-113-7），混合均匀，室温反应10 min后，向其中加入40 μL 10%氯化钠溶液，静置2 h，观察各管颜色变化。 [12] 赫丽娜，刘帅，孙瑾。纳米金溶胶的制备与应用研究[J]。科技信息，2009，13（2）：30-31。
Gold nanoparticle immunochromatographic assay for
quantitative detection of urinary RBP
XU Kuan， SHEN Hebai， ZHU Longzhang*
（College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234， China）
Abstract： A rapid quantitative detection of urinary RBP was established by using nano-gold immunochromatography （sandwich method） and trisodium citrate reduction method and a rapid immunochromatographic test strip was developed。 Theimmunochromatographic test strip can quantitatively detect RBP within 15 minutes。 The detection limit was 150ng/mL and detection range was from 150 to 5000 ng/mL。 There were no cross-reactions with others kidney disease markers，such as urinary albumin （ALB），transferrin protein （TRF），β2-microglobulin （β2-MG），urinary fiber connecting protein （FN），and lysozyme （LZM）。 The results indicate that it is a quick and simple method with strong specificity，high sensitivity，and wide detection range。 The rapid detection method will have extensive clinical applications in the early diagnosis of proximal tubular damage，kidney disease，diabetic nephropathy，and process monitoring。
Key words： Urinary RBP； nano-gold； immunochromatographic assay； quantitative detection
（责任编辑：郁 慧）