【摘 要】
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目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培
【机 构】
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郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所,郧阳医学院附属人民医院泌尿外科研究所,郧阳医学院基础医学研究所,郧阳医学院药理学教研室
【基金项目】
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国家自然科学基金;十堰市人民医院研究生启动金资助项目;教育部科学技术研究项目;郧阳医学院博士研究生启动金;湖北省自然科学基金;教育厅中青年项目
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目的:研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶(human endothelial nitric oxide synthase,heNOS)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的表达. 方法:体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞,并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定;用Pme I 线性化后去磷酸化的pShuttle-heNOS-EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的感受态BJ 5183,使其在细菌内发生同源重组,获得阳性重组质粒pAdEasy-heNOS-EGFP.重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经PacⅠ酶切,转入AD 293 细胞,包装成重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP.用重组腺病毒Ad-heNOS-EGFP对MSCs进行转染,并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达. 结果:pShuttle-heNOS-EGFP与pAdeasy-1在BJ 5183中成功地发生了同源重组, 得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-heNOS-EGFP.重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad- heNOS-EGFP.经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP. 结论:采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中,并得到有效表达,且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况,这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径.
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