成年大鼠压迫性脊髓损伤后损伤区神经干细胞的分离培养实验研究

来源 :中国修复重建外科杂志 | 被引量 : 0次 | 上传用户:JK0803_hlw
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目的研究脊髓损伤后损伤反应性巢蛋白(nestin)和胶质酸性纤维蛋白(glial fi brillary acid protein,GFAP)阳性共存(nestin+/GFAP+)细胞的分裂、增殖和分化能力,以探讨其是否具有神经干细胞(neural stem cells,NSCs)特性。方法8周龄雄性SD大鼠12只,体重200~250 g,随机分为正常对照组和模型组(n=6)。模型组利用动脉瘤夹压迫法建立成年大鼠脊髓损伤动物模型,正常对照组不作任何处理。造模后5 d,两组分别取大鼠T8脊髓节段,分离中央管周围室管膜区以外的脊髓灰质和白质,制成单细胞悬液,用无血清NSCs培养基进行培养,并用含血清NSCs培养基进行诱导分化,利用免疫荧光化学和流式细胞仪观察细胞类型及分裂、分化、增殖能力。结果模型组培养后3~7 d,单细胞悬液中有大量高度表达的nestin+/GFAP+共存细胞,细胞计数为5.15±0.71;对照组为1.12±0.38;两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。细胞周期结果示,模型组S期细胞比例(15.49%±3.04%)及增殖指数(15.88%±2.56%)均明显高于对照组(5.84%±0.28%,6.47%±0.61%),两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。模型组原代细胞逐渐形成边缘光滑、中心膨隆有立体感的小克隆球,nestin免疫荧光染色呈强阳性,多次传代后获得大量细胞克隆球。对照组单细胞悬液原代及传代培养均未见明显克隆球生长。免疫染色结果示模型组克隆球诱导分化约5 d,细胞球中含有大量半乳糖脑苷脂(galactocerebroside,GaLC)-nestin免疫染色阳性细胞;5~7 d,大量β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)-nestin和GFAP免疫染色阳性细胞;7~14 d出现GaLC阳性少突胶质细胞、β-tubulinⅢ神经元和GFAP染色阳性的胞体及细胞突起。结论成年大鼠压迫性脊髓损伤后,剔除中央管周围室管膜区脊髓白质与灰质分离而得的nestin+/GFAP+细胞,具有自我更新能力和多分化潜能,是中枢神经系统的NSCs。
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