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摘要：目的 优选治前胶囊的提取工艺，为将该制剂开发成中药新药提供依据。方法 以浸泡时间、加水量、提取时间为主要影响因素，以浸膏得率和秦皮乙素浸出量为评价指标，采用单因素试验和星点设计-效应面法优选治前胶囊的最佳提取工艺。结果 优选的最佳提取工艺条件为：回流提取2次，第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水、提取2 h。结论 优选的最佳提取工艺条件对秦皮乙素提取效率高，经济、合理、简单可行。
关键词：治前胶囊；星点设计-效应面法；提取工艺；秦皮乙素
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0083-04
前列腺炎是男科临床常见的难治性泌尿系统疾病，严重影响患者的生活质量，因此治疗前列腺炎的方药研究越来越受到重视。治前胶囊由紫花地丁、千里光、金银花等药味组成，在沅陵县中医男性病医院（省级重点专科-不育不孕专科医院）使用20余年，疗效确切。方中紫花地丁为君药，清热解毒、凉血消肿，具有明显的抗菌、抗病毒、消炎作用，现代研究表明秦皮乙素为其主要药效成分[1]，对治疗细菌性前列腺炎有很好的疗效。目前，对于提取工艺的研究多采用正交试验法，易忽略多个因素面间的相互影响，降低了提取效率。本试验以浸膏得率、秦皮乙素浸出量为考察指标，在单因素试验的基础上，采用星点设计-效应面法优选该方最佳水提工艺方法，准确度高，预测指导性更强，为将治前胶囊开发成中药新药提供试验依据。
1 仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪（紫外可变波长检测器，Agilent Chemstation色谱工作站）；Welchrom- C18柱；AR124CN电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；RE-52C旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；HH-600三用恒温水箱（金坛市神科仪器厂）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。
紫花地丁、金银花、千里光、鱼腥草、知母（湖南君昊中药饮片科贸有限公司，批号130901，经湖南中医药大学药学院鉴定教研室刘塔斯教授鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定）；秦皮乙素对照品（供含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号110741-200506）；甲醇为色谱纯，水为怡宝纯净水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 秦皮乙素含量测定
2.1.1 色谱条件 Welchrom C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），甲醇-0.1%磷酸水溶液（19∶81）为流动相，检测波长为349 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃[2-3]。
2.1.2 对照品溶液的制备 取秦皮乙素对照品15 mg，精密称定，置250 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 取提取液，配制成50%甲醇溶液，3000 r/min 离心15 min，取上清液，即得。
2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取浓度分别为3.1、6.2、12.4、18.6、24.8、31.0、62.0 μg/mL的对照品溶液10 μL进样，测定秦皮乙素峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=34.684X-11.13（r2=0.999 7），秦皮乙素在0.031～0.620 μg范围内呈良好的线性关系。
2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液，重复进样6次，测定秦皮乙素峰面积。结果RSD=0.30%，说明仪器精密度良好。
2.1.6 重复性试验 取同一批药材，按“2.1.3”项下方法，平行6份，测定秦皮乙素峰面积。结果RSD=0.72%，说明本方法重复性良好。
2.1.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，测定秦皮乙素峰面积，RSD=0.61%，说明供试品在12 h内稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的提取液样品5 mL，共6份，分别精密加入秦皮乙素对照品溶液2.5 mL，按“2.1.3”项下方法制备，吸取10 μL，注入色谱仪，测定。结果秦皮乙素的平均加样回收率为100.51%，RSD=2.12%，说明供试品回收率良好。
2.1.9 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1。
2.2 优选最佳提取工艺
2.2.1 提取次数的选择 因提取次数为非连续变量，回归处理较困难，因此采用单因素试验[4]进行选择。按处方量称取紫花地丁30 g、鱼腥草30 g、金银花30 g、千里光30 g、知母20 g，加10倍量水提取3次，每次2 h，滤过，合并前2次提取液，按“2.1.3”项下方法制备，测定前2次合并提取液与第3次提取液中秦皮乙素的含量和浸膏得率（见表1）。结果表明，提取2次的秦皮乙素浸出量已超过90%，从节约生产成本的因素考虑，将提取次数定为2次。
2.2.2 试验设计与结果 根据单因素试验结果，选取浸泡时间、加水量、提取时间3个考察因素，每个因素设5个水平，并以浸膏得率和秦皮乙素浸出量为指标，两指标所占百分比分别为40%、60%，进行综合评分，对总分进行方差分析。用星点设计三因素五水平[5]安排试验（见表2），试验设计及结果见表3，采用design-expert软件对试验结果进行统计学处理，方差分析见表4。
2.2.3 模型拟合与方差分析 采用design-expert 7.0.0软件处理数据，以综合评分为指标进行二项式拟合，得到二项式拟合方程R=74.85+0.70A+19.21B+4.45C+0.72AB+0.36AC-1.83BC+1.60A2-4.98B2+2.89C2（r2=0.980 5）。结果表明，多元二项式拟合方程相关系数较高，拟合效果较好。其中，A、B、C、A2、B2、C2项为三因素的单独影响，而AB、AC、BC项为因素间的交互作用。采用ANOVA分析效应面回归参数，由表4可知，A（浸泡时间）没有显著影响，B（加水量）、C（提取时间）有极显著影响，所有交互项没有显著影响。二项式回归方程失拟项没有显著差异，拟合项差异极显著，说明模型的拟合效果很好，可以对不同条件下的提取工艺进行预测。 2.2.4 效应面优化、预测与验证 根据二次多项式模型，绘制三因素综合评分与各因素间的三维效应面图，见图2。
采用design-expert软件对模型进行优化，根据各因素水平的范围，选择效应值极大值，筛选得到最佳的提取工艺条件：浸泡时间1.59 h，加水量18.76倍，提取时间4.69 h，此时综合评分预测值为97.85。考虑到生产实际及浸泡时间没有显著影响，对各因素进行调整，确定最佳的提取工艺条件：浸泡时间0 h，提取2次，第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水，提取2 h。
在选取的最佳工艺条件下，按处方量称取紫花地丁30 g、鱼腥草30 g、金银花30 g、千里光30 g、知母20 g，平行进行3次验证试验（见表5），进行理论值与实测值的比较：理论值为97.85，实测值为99.09，偏差率[（实测值-理论值）÷理论值×100%]为1.27%，表明所建立的数学模型具有良好的预测性[6]，所选的最佳工艺条件重现性好。
3 讨论
目前针对制剂提取工艺的研究多数采用正交设计的方法，考察的是线和线之间的关系，对面间的关系考察不足，没有考虑到各因素间的相互作用，但在实际生产过程中，各因素间往往存在着较大的共同作用[7]。星点设计试验是在单因素试验的基础上建立的，确定中心点，避免最佳值与预测值间的偏离，且考虑到了面和面间相互的影响作用，对优选最佳工艺条件的预测性好。采用design-expert软件对试验进行安排，对数据进行处理，简单方便，可信度高，与正交设计、均匀设计相比更加直观、全面。
本试验采用星点设计-效应面法优选治前胶囊的最佳提取工艺，以浸泡时间、加水量、提取时间为主要影响因素，以浸膏得率、秦皮乙素浸出量为评价指标，对各指标进行加权综合评分，对面间的关系进行考察，充分考虑到了各因素之间的相互影响。最终确定治前胶囊的最佳提取工艺条件为：回流提取2次， 第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水、提取2 h。结果表明，本工艺方法简单可行、经济、合理，对秦皮乙素的提取效率高，适用于工业化生产。
参考文献：
[1] 胥爱丽，江洁仪，罗文汇，等.HPLC法测定紫花地丁配方颗粒中秦皮乙素的含量[J].江西中医药，2013，44（3）：61-62.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：254.
[3] 王冬萍，周建华，蒋慧.HPLC法测定二丁片中秦皮乙素的含量[J].中国保健营养，2012，22（10）：1566-1567.
[4] 陈卫卫，冯看，彭晶蕊.星点设计-效应面法优选抗炎退热颗粒的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（9）：41-43.
[5] 涂瑶生，李绍林，孙冬梅，等.星点设计-效应面法优选苦参提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（5）：34-37.
[6] 刘艳杰，项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J].中国现代应用药学，2007，24（6）：455-457.
[7] 欧阳小光，杨璐.星点设计-效应面法优选五味子提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2012，19（4）：58-60.
（收稿日期：2014-10-28；编辑：陈静）
关键词：治前胶囊；星点设计-效应面法；提取工艺；秦皮乙素
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）06-0083-04
前列腺炎是男科临床常见的难治性泌尿系统疾病，严重影响患者的生活质量，因此治疗前列腺炎的方药研究越来越受到重视。治前胶囊由紫花地丁、千里光、金银花等药味组成，在沅陵县中医男性病医院（省级重点专科-不育不孕专科医院）使用20余年，疗效确切。方中紫花地丁为君药，清热解毒、凉血消肿，具有明显的抗菌、抗病毒、消炎作用，现代研究表明秦皮乙素为其主要药效成分[1]，对治疗细菌性前列腺炎有很好的疗效。目前，对于提取工艺的研究多采用正交试验法，易忽略多个因素面间的相互影响，降低了提取效率。本试验以浸膏得率、秦皮乙素浸出量为考察指标，在单因素试验的基础上，采用星点设计-效应面法优选该方最佳水提工艺方法，准确度高，预测指导性更强，为将治前胶囊开发成中药新药提供试验依据。
1 仪器与试药
Agilent 1200高效液相色谱仪（紫外可变波长检测器，Agilent Chemstation色谱工作站）；Welchrom- C18柱；AR124CN电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司）；RE-52C旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；HH-600三用恒温水箱（金坛市神科仪器厂）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。
紫花地丁、金银花、千里光、鱼腥草、知母（湖南君昊中药饮片科贸有限公司，批号130901，经湖南中医药大学药学院鉴定教研室刘塔斯教授鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》规定）；秦皮乙素对照品（供含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号110741-200506）；甲醇为色谱纯，水为怡宝纯净水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 秦皮乙素含量测定
2.1.1 色谱条件 Welchrom C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm），甲醇-0.1%磷酸水溶液（19∶81）为流动相，检测波长为349 nm，流速为1.0 mL/min，柱温30 ℃[2-3]。
2.1.2 对照品溶液的制备 取秦皮乙素对照品15 mg，精密称定，置250 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 供试品溶液的制备 取提取液，配制成50%甲醇溶液，3000 r/min 离心15 min，取上清液，即得。
2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取浓度分别为3.1、6.2、12.4、18.6、24.8、31.0、62.0 μg/mL的对照品溶液10 μL进样，测定秦皮乙素峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=34.684X-11.13（r2=0.999 7），秦皮乙素在0.031～0.620 μg范围内呈良好的线性关系。
2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下对照品溶液，重复进样6次，测定秦皮乙素峰面积。结果RSD=0.30%，说明仪器精密度良好。
2.1.6 重复性试验 取同一批药材，按“2.1.3”项下方法，平行6份，测定秦皮乙素峰面积。结果RSD=0.72%，说明本方法重复性良好。
2.1.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、10、12 h进样，测定秦皮乙素峰面积，RSD=0.61%，说明供试品在12 h内稳定性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的提取液样品5 mL，共6份，分别精密加入秦皮乙素对照品溶液2.5 mL，按“2.1.3”项下方法制备，吸取10 μL，注入色谱仪，测定。结果秦皮乙素的平均加样回收率为100.51%，RSD=2.12%，说明供试品回收率良好。
2.1.9 专属性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件测定，色谱图见图1。
2.2 优选最佳提取工艺
2.2.1 提取次数的选择 因提取次数为非连续变量，回归处理较困难，因此采用单因素试验[4]进行选择。按处方量称取紫花地丁30 g、鱼腥草30 g、金银花30 g、千里光30 g、知母20 g，加10倍量水提取3次，每次2 h，滤过，合并前2次提取液，按“2.1.3”项下方法制备，测定前2次合并提取液与第3次提取液中秦皮乙素的含量和浸膏得率（见表1）。结果表明，提取2次的秦皮乙素浸出量已超过90%，从节约生产成本的因素考虑，将提取次数定为2次。
2.2.2 试验设计与结果 根据单因素试验结果，选取浸泡时间、加水量、提取时间3个考察因素，每个因素设5个水平，并以浸膏得率和秦皮乙素浸出量为指标，两指标所占百分比分别为40%、60%，进行综合评分，对总分进行方差分析。用星点设计三因素五水平[5]安排试验（见表2），试验设计及结果见表3，采用design-expert软件对试验结果进行统计学处理，方差分析见表4。
2.2.3 模型拟合与方差分析 采用design-expert 7.0.0软件处理数据，以综合评分为指标进行二项式拟合，得到二项式拟合方程R=74.85+0.70A+19.21B+4.45C+0.72AB+0.36AC-1.83BC+1.60A2-4.98B2+2.89C2（r2=0.980 5）。结果表明，多元二项式拟合方程相关系数较高，拟合效果较好。其中，A、B、C、A2、B2、C2项为三因素的单独影响，而AB、AC、BC项为因素间的交互作用。采用ANOVA分析效应面回归参数，由表4可知，A（浸泡时间）没有显著影响，B（加水量）、C（提取时间）有极显著影响，所有交互项没有显著影响。二项式回归方程失拟项没有显著差异，拟合项差异极显著，说明模型的拟合效果很好，可以对不同条件下的提取工艺进行预测。 2.2.4 效应面优化、预测与验证 根据二次多项式模型，绘制三因素综合评分与各因素间的三维效应面图，见图2。
采用design-expert软件对模型进行优化，根据各因素水平的范围，选择效应值极大值，筛选得到最佳的提取工艺条件：浸泡时间1.59 h，加水量18.76倍，提取时间4.69 h，此时综合评分预测值为97.85。考虑到生产实际及浸泡时间没有显著影响，对各因素进行调整，确定最佳的提取工艺条件：浸泡时间0 h，提取2次，第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水，提取2 h。
在选取的最佳工艺条件下，按处方量称取紫花地丁30 g、鱼腥草30 g、金银花30 g、千里光30 g、知母20 g，平行进行3次验证试验（见表5），进行理论值与实测值的比较：理论值为97.85，实测值为99.09，偏差率[（实测值-理论值）÷理论值×100%]为1.27%，表明所建立的数学模型具有良好的预测性[6]，所选的最佳工艺条件重现性好。
3 讨论
目前针对制剂提取工艺的研究多数采用正交设计的方法，考察的是线和线之间的关系，对面间的关系考察不足，没有考虑到各因素间的相互作用，但在实际生产过程中，各因素间往往存在着较大的共同作用[7]。星点设计试验是在单因素试验的基础上建立的，确定中心点，避免最佳值与预测值间的偏离，且考虑到了面和面间相互的影响作用，对优选最佳工艺条件的预测性好。采用design-expert软件对试验进行安排，对数据进行处理，简单方便，可信度高，与正交设计、均匀设计相比更加直观、全面。
本试验采用星点设计-效应面法优选治前胶囊的最佳提取工艺，以浸泡时间、加水量、提取时间为主要影响因素，以浸膏得率、秦皮乙素浸出量为评价指标，对各指标进行加权综合评分，对面间的关系进行考察，充分考虑到了各因素之间的相互影响。最终确定治前胶囊的最佳提取工艺条件为：回流提取2次， 第1次加10倍量水、提取2.5 h，第2次加8倍量水、提取2 h。结果表明，本工艺方法简单可行、经济、合理，对秦皮乙素的提取效率高，适用于工业化生产。
参考文献：
[1] 胥爱丽，江洁仪，罗文汇，等.HPLC法测定紫花地丁配方颗粒中秦皮乙素的含量[J].江西中医药，2013，44（3）：61-62.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：254.
[3] 王冬萍，周建华，蒋慧.HPLC法测定二丁片中秦皮乙素的含量[J].中国保健营养，2012，22（10）：1566-1567.
[4] 陈卫卫，冯看，彭晶蕊.星点设计-效应面法优选抗炎退热颗粒的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（9）：41-43.
[5] 涂瑶生，李绍林，孙冬梅，等.星点设计-效应面法优选苦参提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（5）：34-37.
[6] 刘艳杰，项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J].中国现代应用药学，2007，24（6）：455-457.
[7] 欧阳小光，杨璐.星点设计-效应面法优选五味子提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2012，19（4）：58-60.
（收稿日期：2014-10-28；编辑：陈静）