论文部分内容阅读
摘 要：以甜叶菊为原料，采用超声辅助纤维素酶法提取甜菊糖，以甜菊糖提取率为指标，在单因素试验的基础上，通过响应面法分析得出最佳工艺条件;再用滤纸片法测定甜菊糖的抑菌活性，用液体培养法测定甜菊糖的最小抑菌浓度（MIC）。结果表明：最佳提取工艺条件为纤维素酶量0.5%，超声时间35min，超声温度50℃，在此条件下，甜菊糖的提取率为18.86%;甜菊糖对4种供试菌均有抑制作用，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉、根霉的最小抑菌浓度分别为20、40、10、80mg/mL。
关键词：甜菊糖;响应面法;抑菌活性;最小抑菌浓度（MIC）
中图分类号 TS201.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）21-0030-06
Abstract：Stevia rebaudiana was used as raw material to extract stevioside by cellulase assisted by ultrasound.With the extraction rate of stevioside as the index，the optimum technological conditions were obtained by response surface methodology on the basis of single factor experiments.Then the antimicrobial activity of stevioside was determined by filter paper method，andthe minimum inhibitory concentration （MIC） of stevioside was determined by liquid culture method.The results showed that the optimum extraction conditions were cellulase 0.5%，ultrasonic time 35min and ultrasonic temperature 50 ℃. Under these conditions，the extraction rate of stevioside was 18.86%.Stevioside inhibited all the four tested bacteria，and the minimum inhibitory concentration of stevioside on Escherichia coli，Bacillus subtilis，Mucor and Rhizopus were 20，40，10 and 80 mg/mL，respectively.
Key words： Stevioside;Response face method;Bacterial activity;Minimum inhibitory concentration（MIC）
甜叶菊[Stevia rebaudiana （Bertoni） Hemsl.]是一种菊科甜叶菊属的多年生草本植物。1977年，甜叶菊从日本引入到南京中山植物园、中国农业科学院等科研机构。现如今，中国作为甜叶菊生产国已跃居世界首位，其出口贸易排世界首位。目前，我国甜叶菊主要以原材料或者粗加工的产品出口到发达国家，其精加工生产成品方面的研究仍较少。甜菊糖（Stevioside），又名甜菊糖苷，是一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂[1]，可广泛应用于饮料、蜜饯、果脯、糕点、乳制品或减肥等功能性食品中[2];具有一定药用价值，有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、降血压、降血脂等功效[3];其产生的工业废料，可添加到动物饲料和农作物肥料中使用[4]。甜菊糖在各行各业的广泛应用，提高了其市场开发价值。
目前，甜菊糖的提取方法主要有水浸提法[5]、溶剂萃取法[6]、连续逆流提取法[7]及超声波提取法[8]。其中，超声波辅助纤维素酶法提取，不仅具有操作简单、耗时短、溶剂用量少的优点，还可以有效提高甜菊糖的提取率。本课题旨在单因素试验的基础上结合响应面法，对超声辅助纤维素酶提取甜叶菊中甜菊糖的生产工艺进行优化，并对其进行了抑菌活性的研究，为甜菊糖的深度开发提供有力的实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 材料：甜叶菊，亳州市谯府茶业有限公司生产。试剂：纤维素酶，和氏璧生物工程有限公司生产;苯酚、浓硫酸、葡萄糖标准品、无水乙醇均为分析纯。培养基：LB培养基、察氏培养基、营养琼脂培养基、PDA培养基。菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉和根霉，均为蚌埠学院微生物实验室培养。
1.2 仪器与设备 分析天平，上海海康电子仪器厂生产;高速中药粉碎机，吉首市中诚制药机械厂生产;电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产;超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司生產;台式高速冷冻离心机，湖南可成仪器设备有限公司生产;旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司生产;可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产;立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产;超净工作台，聚创环保高新技术企业有限公司生产;双目显微镜，重庆光电仪器有限公司生产;生化培养箱，广东省医疗器械厂生产。
1.3 试验方法
1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 称取葡萄糖配置成0.2mg/mL葡萄糖溶液。取7支干净的试管并标号，向其中分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL的0.2mg/mL葡萄糖溶液，定容至2.0mL。再加入5%苯酚溶液1.0mL于7支试管中，振荡摇匀，缓慢逐滴加入浓硫酸5.0mL，充分摇匀后静置30min。用0号管作为空白对照进行调零，在波长为490nm处测定1～6号管的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[9]。 1.3.2 原料预处理 取一定量甜叶菊干叶放入中药粉碎机中，粉碎过筛，60℃烘箱中干燥至恒重后，装入试剂瓶备用。
1.3.3 甜菊糖的提取 称取甜葉菊粉末按料液比1∶40（mg/mL）加入蒸馏水，0.5%纤维素酶，pH4.5，50℃超声提取35min，抽滤，向滤渣中加入等体积的蒸馏水，同等条件二次提取。合并滤液加热去除蛋白质等不溶性物质。在25℃条件下，10000r/min，离心10min。离心后，取上清液，浓缩至原体积1/10。加入3倍体积无水乙醇，混合，置于4℃，醇沉12h。在4℃下，4000r/min，离心20min，取出醇沉产物，置于60℃干燥得甜菊糖粗多糖[10]。
1.3.4 甜菊糖提取率的计算[11] 移取滤液0.5mL，稀释80倍后，按1.3.1方法测定490nm波长下吸光度A，并根据回归方程计算待测溶液的甜菊糖质量浓度。甜菊糖提取率计算公式如下：
1.3.5 甜菊糖抑菌试验
1.3.5.1 供试菌种的活化与菌悬液的制备 配置斜面固体培养基，用划线法将4种供试菌种活化（细菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。挑取1环无杂菌污染的单菌落于9mL无菌水中，振荡摇匀，制成一系列菌悬液，浓度约为1.0×106～1.0×108CFU/mL，备用[12]。
1.3.5.2 抑菌效果测定 滤纸片法抑菌效果测定：用打孔器获得6mm圆形滤纸片，与固体培养基、镊子、涂布棒高压灭菌（121℃，20min）。灭菌干燥后的滤纸片分别浸泡在不同的甜菊糖溶液（80、40、20、10、5mg/mL）中2h，备用。用涂布法接种供试菌，吸收后，用无菌镊子夹取滤纸片贴于已涂布有供试菌的平板上，无菌水作为空白对照，培养箱中培养（细菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。培养后，观察滤纸片周围抑菌圈大小并测量，计算取平均值。每一菌种做3组平行试验[13]。
1.3.5.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定 配置80mg/mL的甜菊糖溶液，用二倍稀释法配置好浓度为40、20、10、5mg/mL的甜菊糖溶液，取不同浓度的甜菊糖稀释液各0.1mL于试管中，再分别吸取0.1mL菌悬液和5mL液体培养基于对应的试管中均匀混合，以无菌水作为对照试验。将6支试管放于培养箱培养（细菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h），观察菌落的生长情况，做3组平行试验，将不长菌的甜菊糖最低浓度作为最小抑菌浓度（MIC）。
1.4 试验设计
1.4.1 单因素试验 分别称取5份甜叶菊干叶粉末1g，以水为提取液，选取料液比、纤维素酶量、溶液pH、超声温度、超声时间5个因素，以甜菊糖提取率为衡量标准，进行单因素试验。
1.4.2 响应面试验 依据 Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，选取对甜菊糖提取率有较显著影响的3个因素，即纤维素酶量、超声温度、超声时间。设计3因素3水平的响应面分析试验方案，优化超声波辅助纤维素酶提取甜叶菊中甜菊糖的提取工艺，分别用A、B、C代表纤维素酶量（%）、超声温度（℃）、超声时间（min）3个因素，用-1、0、1代表变量的3个水平，对自变量进行编码，响应面分析因素与水平编码表见表1。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线 葡萄糖标准曲线回归方程y=11.036x-0.0015，R2=0.9995，式中：x为葡萄糖质量浓度，mg/mL;y为吸光度，见图1。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶量0.5%、溶液pH4.5、超声温度50℃、超声时间35min条件下，研究料液比（W/V）1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60对甜菊糖提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，甜菊糖的提取率在1∶20～1∶40（W/V）料液比，随着溶剂量的增加而增大，在1∶40（W/V）料液比处出现峰值，此后甜菊糖的提取率呈下降的趋势。分析其原因，可能是因为添加溶剂的量超过最适值后，溶剂会吸收掉部分超声波辐射，用于溶解杂质的溶剂量增多，在样品提取上的用量却减少了。故初步判定当料液比达到1∶40（W/V）时，对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.2.2 纤维素酶量对甜菊糖提取率的影响 在料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超声温度50℃、超声时间35min条件下，研究纤维素酶量0、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%对甜菊糖提取率的影响，结果如图3所示。由图3可知，在0～0.50%纤维素酶量，甜菊糖的提取率不断升高，并在0.5%纤维素酶量处达到峰值。当纤维素酶量大于0.50%之后，甜菊糖的提取率趋于平缓，这可能是因为底物已处于饱和状态。因此，可初步判定0.50%纤维素酶量对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.2.3 超声温度对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶酶量0.5%、料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超声时间35min条件下，研究超声温度35、40、45、50、55℃对甜菊糖提取率的影响，结果如图4所示。由图4可知，在20～50℃，甜菊糖的提取率不断增大，并在超声温度50℃时达到峰值。当超声温度高于50℃之后，甜菊糖的提取率逐渐下降，可能由于超声温度达到50℃时，纤维素酶活力达到最大，当温度高于50℃时，纤维素酶的活力降低，从而影响了甜菊糖的溶出。故可初步判定超声温度50℃对提取甜叶菊的甜菊糖影响最显著。 2.2.4 超声时间对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶量0.5%、料液比（W/V）1：40、溶液pH4.5、超声溫度50℃条件下，研究超声时间25、30、35、40、45min对甜菊糖提取率的影响，结果如图5所示。由图5可知，在25～35min，甜菊糖的提取率不断增加并在35min处达到峰值。当超声时间多于35min，甜菊糖的提取率呈下降的趋势。分析这一趋势可能是因为随着提取时间的增加，甜菊糖分子在超声波的作用下被破坏和降解，溶液中杂质增多，提取率下降。故可初步判定超声时间35min对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.2.5 溶液pH对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶量0.5%、料液比（W/V）1∶40、超声温度50℃、超声时间35min条件下，研究溶液pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5对甜菊糖提取率的影响，结果如图6所示。由图6可知，在pH3.5～4.5，甜菊糖的提取率不断增大，并在pH4.5处达到峰值。当pH大于4.5之后，甜菊糖的提取率呈下降的趋势，其原因可能是在pH4.5处纤维素酶的活力最大，后随着pH的增大纤维素酶的活力逐渐减小，从而影响了甜菊糖的溶出。故可初步判定pH4.5对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.3 响应面优化甜菊糖提取工艺
2.3.1 Box-Benhnken设计试验结果 依据Box-Behnken原理设计试验，结合单因素试验结果确定因素的水平范围，将甜菊糖提取率作为响应值，进行3因素3水平的响应面分析，见表2。
由表2可知，当超声时间35min，超声温度50℃，纤维素酶量0.5%时，甜菊糖的提取率最高为18.86%。采用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析，从而对本课题进行更深入的研究和条件优化，并做出响应面图。多元回归拟合分析得到甜菊糖提取率与各因素变量的二次方程模型为：Y=18.65+0.52×A+0.40×B+0.46×C-0.035×AB+0.048×AC+0.072×BC-1.66×A2-1.52×B2-1.65×C2。方差分析结果见表3。
由表3可知，该模型的P值<0.0001，表明回归方程极显著，失拟项P值>0.05不显著，且R2=0.9411，R2adj=0.9855，说明该模型与试验拟合较好，预测值与实际值具有高度的相关性，可直接利用回归方程对本课题的工艺进行分析和预测。另外，模型中的一次项A、B、C的P值均<0.05，影响显著;二次项A2、B2、C2的P值均<0.0001，影响极显著;交互项AB、AC、BC的P值均>0.05，影响不显著。根据F值的大小可以判断各因素对试验结果的影响顺序为：A>C>B，即纤维素酶量>超声时间>超声温度。
2.3.2 响应面及等高线结果 通过回归模型，可以分别得到任意2个因素及其交叉作用对甜菊糖提取率的等高线和响应面图。纤维素酶量和超声温度对甜菊糖提取率的影响见图7，纤维素酶量和超声时间对甜菊糖提取率的影响见图8，超声温度和超声时间对甜菊糖提取率的影响见图9。
由图7可知，当固定纤维素酶量不变时，甜菊糖的提取率随着超声温度的升高而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小;而当固定超声温度不变时，甜菊糖的提取率随着纤维素酶量的增大而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小。表明甜菊糖提取率受纤维素酶量和超声温度的影响较大。
由图8可知，当固定纤维素酶量不变时，甜菊糖提取率随着超声时间的增加而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小;而当固定超声时间不变时，甜菊糖提取率随着纤维素酶量的增大而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小。表明甜菊糖提取率受纤维素酶量和超声时间的影响较大。
由图9可知，当固定超声温度不变时，甜菊糖提取率随着超声时间的增加而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小;而当固定超声时间不变时，甜菊糖提取率随着超声温度的升高而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小。表明甜菊糖提取率受超声温度和超声时间的影响较大。
2.3.3 验证试验 通过Design Expert 8.0.6软件分析得到，从甜叶菊中提取甜菊糖的最优工艺条件为：纤维素酶量0.539%，超声时间35.716min，超声温度50.660℃，此时甜菊糖的提取率为18.754%。参照最优条件，并结合实际最终确定的最优工艺优化方案为：纤维素酶量0.5%，超声时间35min，超声温度50℃。根据最终优化方案进行验证试验，得到甜菊糖的提取率为18.86%，与模型的理论值相差0.106%。由此可知，通过这一模型来对本课题的研究进行优化是可行的。
2.4 甜菊糖的抑菌性
2.4.1 抑菌圈 采用滤纸片法研究甜菊糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉、根霉的抑制效果，选取浓度为80、40、20、10、5mg/mL的甜菊糖溶液，通过比较抑菌圈直径大小判断其对供试菌的抑制活性强弱，实验结果见表4。从表4可以看出，甜菊糖对供试菌均有一定的抑菌效果，随着甜菊糖溶液浓度的降低，抑菌圈直径减小。实验结果表明：当甜菊糖浓度较高时，对细菌的抑制效果强于真菌;当甜菊糖浓度较低时，对真菌的抑制效果更显著。在细菌中，甜菊糖对大肠杆菌的抑制效果更显著，当甜菊糖浓度在20mg/mL时，大肠杆菌即出现抑菌圈，而枯草芽孢杆菌在甜菊糖浓度为40mg/mL时，才有抑菌圈出现。在真菌中，甜菊糖对毛霉的抑制效果更显著，当甜菊糖浓度在5mg/mL时，毛霉就已出现抑菌圈，而根霉在甜菊糖浓度为40mg/mL时才观察到抑菌圈。 2.4.2 最小抑菌浓度 通过抑菌效果测定实验分析，甜菊糖对4种供试菌都有一定的抑制作用。因此，可采用二倍法稀释甜菊糖溶液加入到液体培养基中，观察不同供试菌的生长情况，将培养基中不长菌时的甜菊糖最低浓度作为最小抑菌浓度（MIC），实验结果见表5。结合抑菌效果测定结果：当甜菊糖浓度较高时，对细菌的抑制效果更显著，当甜菊糖浓度较低时，对霉菌的抑制效果更显著。从表5可以看出，随着甜菊糖浓度降低，培养基中开始有菌生长。从实验结果来看，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉、根霉的最小抑菌浓度（MIC）分别为20、40、10、80mg/mL。
3 结论
本文采用Design Expert 8.0.6 软件，通过响应面分析得到甜菊糖提取率和纤维素酶量、超声温度、超声时间3因素的模型方程，各因素对甜菊糖提取率的影响从大到小依次为纤维素酶量>超声时间>超声温度。最佳提取工艺参数为纤维素酶0.5%，超声温度50℃，超声时间35min，在此条件下，甜菊糖的提取率为18.86%。因此，在保证甜菊糖提取率的前提下，利用超声波辅助纤维素酶提取甜叶菊中的甜菊糖的提取更为高效。
甜菊糖对4种供试菌均表现出一定的抑制作用，对各供试菌的抑菌性大小为大肠杆菌>枯草芽孢杆菌、毛霉>根霉。当甜菊糖浓度较高时，对细菌的抑制效果比霉菌更顯著;当甜菊糖浓度较低时，对霉菌的抑制效果比细菌更显著。其中，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉、根霉的最小抑菌浓度（MIC）分别为20、40、10、80mg/mL。
参考文献
[1]赵秀玲.我国甜味剂甜菊糖苷发展状况[J].中国调味品，2009，34（05）：110-113.
[2]刘贵君，石浩.甜菊糖的应用研究进展[J].浙江化工，2016，47（11）：34-41.
[3]陈育如，杨凤平，杨帆，等.甜叶菊及甜菊糖的多效功能与保健应用[J].南京师大学报（自然科学版），2016，39（02）：56-60.
[4]杨洋，李启明，高航，等.甜菊糖苷功能特性与应用现状[J].食品工业，2018，39（11）：270-272.
[5]张丽娜，于涛，高冷.从甜菊叶中提取和精制甜菊苷的工艺研究[J].中国调味品，2008（01）：58-59，64.
[6]王永祥，祁斌，何唯东，等.溶剂法提取甜叶菊甙（Ⅰ）[J].杭州师院学报（自然科学版），1984（S1）：24-25.
[7]郁军，岳鹏翔，郁红，等.三级逆流法提取甜菊糖甙的工艺研究[J].食品科学，2009，30（02）：146-148.
[8]万水昌，王志祥，乐龙，等.超声提取技术在中药及天然产物提取中的应用[J].西北药学杂志，2008（01）：60-62.
[9]黄琼，何燕萍.超声波辅助提取玫瑰茄多糖工艺研究[J].食品研究与开发，2019，40（05）：123-127.
[10]王雨东.虫草多糖酶提取及纯化工艺研究和优化[D].上海：华东理工大学，2017.
[11]黎英，陈雪梅，严月萍，等.超声波辅助酶法提取红腰豆多糖工艺优化[J].农业工程学报，2015，31（15）：293-301.
[12]孟宪军，刘晓晶，孙希云，等.蓝莓多糖的抗氧化性与抑菌作用[J].食品科学，2010，31（17）：110-114.
[13]孙义玄，包怡红.艾蒿多糖抑菌活性及稳定性[J].食品与生物技术学报，2017，36（09）：990-995.
（责编：张宏民）
关键词：甜菊糖;响应面法;抑菌活性;最小抑菌浓度（MIC）
中图分类号 TS201.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）21-0030-06
Abstract：Stevia rebaudiana was used as raw material to extract stevioside by cellulase assisted by ultrasound.With the extraction rate of stevioside as the index，the optimum technological conditions were obtained by response surface methodology on the basis of single factor experiments.Then the antimicrobial activity of stevioside was determined by filter paper method，andthe minimum inhibitory concentration （MIC） of stevioside was determined by liquid culture method.The results showed that the optimum extraction conditions were cellulase 0.5%，ultrasonic time 35min and ultrasonic temperature 50 ℃. Under these conditions，the extraction rate of stevioside was 18.86%.Stevioside inhibited all the four tested bacteria，and the minimum inhibitory concentration of stevioside on Escherichia coli，Bacillus subtilis，Mucor and Rhizopus were 20，40，10 and 80 mg/mL，respectively.
Key words： Stevioside;Response face method;Bacterial activity;Minimum inhibitory concentration（MIC）
甜叶菊[Stevia rebaudiana （Bertoni） Hemsl.]是一种菊科甜叶菊属的多年生草本植物。1977年，甜叶菊从日本引入到南京中山植物园、中国农业科学院等科研机构。现如今，中国作为甜叶菊生产国已跃居世界首位，其出口贸易排世界首位。目前，我国甜叶菊主要以原材料或者粗加工的产品出口到发达国家，其精加工生产成品方面的研究仍较少。甜菊糖（Stevioside），又名甜菊糖苷，是一种高甜度、低热量的新型天然甜味剂[1]，可广泛应用于饮料、蜜饯、果脯、糕点、乳制品或减肥等功能性食品中[2];具有一定药用价值，有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、降血压、降血脂等功效[3];其产生的工业废料，可添加到动物饲料和农作物肥料中使用[4]。甜菊糖在各行各业的广泛应用，提高了其市场开发价值。
目前，甜菊糖的提取方法主要有水浸提法[5]、溶剂萃取法[6]、连续逆流提取法[7]及超声波提取法[8]。其中，超声波辅助纤维素酶法提取，不仅具有操作简单、耗时短、溶剂用量少的优点，还可以有效提高甜菊糖的提取率。本课题旨在单因素试验的基础上结合响应面法，对超声辅助纤维素酶提取甜叶菊中甜菊糖的生产工艺进行优化，并对其进行了抑菌活性的研究，为甜菊糖的深度开发提供有力的实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 材料：甜叶菊，亳州市谯府茶业有限公司生产。试剂：纤维素酶，和氏璧生物工程有限公司生产;苯酚、浓硫酸、葡萄糖标准品、无水乙醇均为分析纯。培养基：LB培养基、察氏培养基、营养琼脂培养基、PDA培养基。菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉和根霉，均为蚌埠学院微生物实验室培养。
1.2 仪器与设备 分析天平，上海海康电子仪器厂生产;高速中药粉碎机，吉首市中诚制药机械厂生产;电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产;超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司生產;台式高速冷冻离心机，湖南可成仪器设备有限公司生产;旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司生产;可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产;立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产;超净工作台，聚创环保高新技术企业有限公司生产;双目显微镜，重庆光电仪器有限公司生产;生化培养箱，广东省医疗器械厂生产。
1.3 试验方法
1.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制 称取葡萄糖配置成0.2mg/mL葡萄糖溶液。取7支干净的试管并标号，向其中分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL的0.2mg/mL葡萄糖溶液，定容至2.0mL。再加入5%苯酚溶液1.0mL于7支试管中，振荡摇匀，缓慢逐滴加入浓硫酸5.0mL，充分摇匀后静置30min。用0号管作为空白对照进行调零，在波长为490nm处测定1～6号管的吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[9]。 1.3.2 原料预处理 取一定量甜叶菊干叶放入中药粉碎机中，粉碎过筛，60℃烘箱中干燥至恒重后，装入试剂瓶备用。
1.3.3 甜菊糖的提取 称取甜葉菊粉末按料液比1∶40（mg/mL）加入蒸馏水，0.5%纤维素酶，pH4.5，50℃超声提取35min，抽滤，向滤渣中加入等体积的蒸馏水，同等条件二次提取。合并滤液加热去除蛋白质等不溶性物质。在25℃条件下，10000r/min，离心10min。离心后，取上清液，浓缩至原体积1/10。加入3倍体积无水乙醇，混合，置于4℃，醇沉12h。在4℃下，4000r/min，离心20min，取出醇沉产物，置于60℃干燥得甜菊糖粗多糖[10]。
1.3.4 甜菊糖提取率的计算[11] 移取滤液0.5mL，稀释80倍后，按1.3.1方法测定490nm波长下吸光度A，并根据回归方程计算待测溶液的甜菊糖质量浓度。甜菊糖提取率计算公式如下：
1.3.5 甜菊糖抑菌试验
1.3.5.1 供试菌种的活化与菌悬液的制备 配置斜面固体培养基，用划线法将4种供试菌种活化（细菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。挑取1环无杂菌污染的单菌落于9mL无菌水中，振荡摇匀，制成一系列菌悬液，浓度约为1.0×106～1.0×108CFU/mL，备用[12]。
1.3.5.2 抑菌效果测定 滤纸片法抑菌效果测定：用打孔器获得6mm圆形滤纸片，与固体培养基、镊子、涂布棒高压灭菌（121℃，20min）。灭菌干燥后的滤纸片分别浸泡在不同的甜菊糖溶液（80、40、20、10、5mg/mL）中2h，备用。用涂布法接种供试菌，吸收后，用无菌镊子夹取滤纸片贴于已涂布有供试菌的平板上，无菌水作为空白对照，培养箱中培养（细菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。培养后，观察滤纸片周围抑菌圈大小并测量，计算取平均值。每一菌种做3组平行试验[13]。
1.3.5.3 最低抑菌浓度（MIC）的测定 配置80mg/mL的甜菊糖溶液，用二倍稀释法配置好浓度为40、20、10、5mg/mL的甜菊糖溶液，取不同浓度的甜菊糖稀释液各0.1mL于试管中，再分别吸取0.1mL菌悬液和5mL液体培养基于对应的试管中均匀混合，以无菌水作为对照试验。将6支试管放于培养箱培养（细菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h），观察菌落的生长情况，做3组平行试验，将不长菌的甜菊糖最低浓度作为最小抑菌浓度（MIC）。
1.4 试验设计
1.4.1 单因素试验 分别称取5份甜叶菊干叶粉末1g，以水为提取液，选取料液比、纤维素酶量、溶液pH、超声温度、超声时间5个因素，以甜菊糖提取率为衡量标准，进行单因素试验。
1.4.2 响应面试验 依据 Box-Behnken中心组合试验设计原理，在单因素试验基础上，选取对甜菊糖提取率有较显著影响的3个因素，即纤维素酶量、超声温度、超声时间。设计3因素3水平的响应面分析试验方案，优化超声波辅助纤维素酶提取甜叶菊中甜菊糖的提取工艺，分别用A、B、C代表纤维素酶量（%）、超声温度（℃）、超声时间（min）3个因素，用-1、0、1代表变量的3个水平，对自变量进行编码，响应面分析因素与水平编码表见表1。
2 结果与分析
2.1 葡萄糖标准曲线 葡萄糖标准曲线回归方程y=11.036x-0.0015，R2=0.9995，式中：x为葡萄糖质量浓度，mg/mL;y为吸光度，见图1。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 料液比对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶量0.5%、溶液pH4.5、超声温度50℃、超声时间35min条件下，研究料液比（W/V）1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60对甜菊糖提取率的影响，结果如图2所示。由图2可知，甜菊糖的提取率在1∶20～1∶40（W/V）料液比，随着溶剂量的增加而增大，在1∶40（W/V）料液比处出现峰值，此后甜菊糖的提取率呈下降的趋势。分析其原因，可能是因为添加溶剂的量超过最适值后，溶剂会吸收掉部分超声波辐射，用于溶解杂质的溶剂量增多，在样品提取上的用量却减少了。故初步判定当料液比达到1∶40（W/V）时，对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.2.2 纤维素酶量对甜菊糖提取率的影响 在料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超声温度50℃、超声时间35min条件下，研究纤维素酶量0、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%对甜菊糖提取率的影响，结果如图3所示。由图3可知，在0～0.50%纤维素酶量，甜菊糖的提取率不断升高，并在0.5%纤维素酶量处达到峰值。当纤维素酶量大于0.50%之后，甜菊糖的提取率趋于平缓，这可能是因为底物已处于饱和状态。因此，可初步判定0.50%纤维素酶量对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.2.3 超声温度对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶酶量0.5%、料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超声时间35min条件下，研究超声温度35、40、45、50、55℃对甜菊糖提取率的影响，结果如图4所示。由图4可知，在20～50℃，甜菊糖的提取率不断增大，并在超声温度50℃时达到峰值。当超声温度高于50℃之后，甜菊糖的提取率逐渐下降，可能由于超声温度达到50℃时，纤维素酶活力达到最大，当温度高于50℃时，纤维素酶的活力降低，从而影响了甜菊糖的溶出。故可初步判定超声温度50℃对提取甜叶菊的甜菊糖影响最显著。 2.2.4 超声时间对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶量0.5%、料液比（W/V）1：40、溶液pH4.5、超声溫度50℃条件下，研究超声时间25、30、35、40、45min对甜菊糖提取率的影响，结果如图5所示。由图5可知，在25～35min，甜菊糖的提取率不断增加并在35min处达到峰值。当超声时间多于35min，甜菊糖的提取率呈下降的趋势。分析这一趋势可能是因为随着提取时间的增加，甜菊糖分子在超声波的作用下被破坏和降解，溶液中杂质增多，提取率下降。故可初步判定超声时间35min对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.2.5 溶液pH对甜菊糖提取率的影响 在纤维素酶量0.5%、料液比（W/V）1∶40、超声温度50℃、超声时间35min条件下，研究溶液pH3.5、4.0、4.5、5.0、5.5对甜菊糖提取率的影响，结果如图6所示。由图6可知，在pH3.5～4.5，甜菊糖的提取率不断增大，并在pH4.5处达到峰值。当pH大于4.5之后，甜菊糖的提取率呈下降的趋势，其原因可能是在pH4.5处纤维素酶的活力最大，后随着pH的增大纤维素酶的活力逐渐减小，从而影响了甜菊糖的溶出。故可初步判定pH4.5对提取甜叶菊中的甜菊糖影响最显著。
2.3 响应面优化甜菊糖提取工艺
2.3.1 Box-Benhnken设计试验结果 依据Box-Behnken原理设计试验，结合单因素试验结果确定因素的水平范围，将甜菊糖提取率作为响应值，进行3因素3水平的响应面分析，见表2。
由表2可知，当超声时间35min，超声温度50℃，纤维素酶量0.5%时，甜菊糖的提取率最高为18.86%。采用Design Expert 8.0.6软件对试验数据进行回归分析，从而对本课题进行更深入的研究和条件优化，并做出响应面图。多元回归拟合分析得到甜菊糖提取率与各因素变量的二次方程模型为：Y=18.65+0.52×A+0.40×B+0.46×C-0.035×AB+0.048×AC+0.072×BC-1.66×A2-1.52×B2-1.65×C2。方差分析结果见表3。
由表3可知，该模型的P值<0.0001，表明回归方程极显著，失拟项P值>0.05不显著，且R2=0.9411，R2adj=0.9855，说明该模型与试验拟合较好，预测值与实际值具有高度的相关性，可直接利用回归方程对本课题的工艺进行分析和预测。另外，模型中的一次项A、B、C的P值均<0.05，影响显著;二次项A2、B2、C2的P值均<0.0001，影响极显著;交互项AB、AC、BC的P值均>0.05，影响不显著。根据F值的大小可以判断各因素对试验结果的影响顺序为：A>C>B，即纤维素酶量>超声时间>超声温度。
2.3.2 响应面及等高线结果 通过回归模型，可以分别得到任意2个因素及其交叉作用对甜菊糖提取率的等高线和响应面图。纤维素酶量和超声温度对甜菊糖提取率的影响见图7，纤维素酶量和超声时间对甜菊糖提取率的影响见图8，超声温度和超声时间对甜菊糖提取率的影响见图9。
由图7可知，当固定纤维素酶量不变时，甜菊糖的提取率随着超声温度的升高而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小;而当固定超声温度不变时，甜菊糖的提取率随着纤维素酶量的增大而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小。表明甜菊糖提取率受纤维素酶量和超声温度的影响较大。
由图8可知，当固定纤维素酶量不变时，甜菊糖提取率随着超声时间的增加而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小;而当固定超声时间不变时，甜菊糖提取率随着纤维素酶量的增大而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小。表明甜菊糖提取率受纤维素酶量和超声时间的影响较大。
由图9可知，当固定超声温度不变时，甜菊糖提取率随着超声时间的增加而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小;而当固定超声时间不变时，甜菊糖提取率随着超声温度的升高而发生变化，表现出来的趋势是先增大后减小。表明甜菊糖提取率受超声温度和超声时间的影响较大。
2.3.3 验证试验 通过Design Expert 8.0.6软件分析得到，从甜叶菊中提取甜菊糖的最优工艺条件为：纤维素酶量0.539%，超声时间35.716min，超声温度50.660℃，此时甜菊糖的提取率为18.754%。参照最优条件，并结合实际最终确定的最优工艺优化方案为：纤维素酶量0.5%，超声时间35min，超声温度50℃。根据最终优化方案进行验证试验，得到甜菊糖的提取率为18.86%，与模型的理论值相差0.106%。由此可知，通过这一模型来对本课题的研究进行优化是可行的。
2.4 甜菊糖的抑菌性
2.4.1 抑菌圈 采用滤纸片法研究甜菊糖对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉、根霉的抑制效果，选取浓度为80、40、20、10、5mg/mL的甜菊糖溶液，通过比较抑菌圈直径大小判断其对供试菌的抑制活性强弱，实验结果见表4。从表4可以看出，甜菊糖对供试菌均有一定的抑菌效果，随着甜菊糖溶液浓度的降低，抑菌圈直径减小。实验结果表明：当甜菊糖浓度较高时，对细菌的抑制效果强于真菌;当甜菊糖浓度较低时，对真菌的抑制效果更显著。在细菌中，甜菊糖对大肠杆菌的抑制效果更显著，当甜菊糖浓度在20mg/mL时，大肠杆菌即出现抑菌圈，而枯草芽孢杆菌在甜菊糖浓度为40mg/mL时，才有抑菌圈出现。在真菌中，甜菊糖对毛霉的抑制效果更显著，当甜菊糖浓度在5mg/mL时，毛霉就已出现抑菌圈，而根霉在甜菊糖浓度为40mg/mL时才观察到抑菌圈。 2.4.2 最小抑菌浓度 通过抑菌效果测定实验分析，甜菊糖对4种供试菌都有一定的抑制作用。因此，可采用二倍法稀释甜菊糖溶液加入到液体培养基中，观察不同供试菌的生长情况，将培养基中不长菌时的甜菊糖最低浓度作为最小抑菌浓度（MIC），实验结果见表5。结合抑菌效果测定结果：当甜菊糖浓度较高时，对细菌的抑制效果更显著，当甜菊糖浓度较低时，对霉菌的抑制效果更显著。从表5可以看出，随着甜菊糖浓度降低，培养基中开始有菌生长。从实验结果来看，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉、根霉的最小抑菌浓度（MIC）分别为20、40、10、80mg/mL。
3 结论
本文采用Design Expert 8.0.6 软件，通过响应面分析得到甜菊糖提取率和纤维素酶量、超声温度、超声时间3因素的模型方程，各因素对甜菊糖提取率的影响从大到小依次为纤维素酶量>超声时间>超声温度。最佳提取工艺参数为纤维素酶0.5%，超声温度50℃，超声时间35min，在此条件下，甜菊糖的提取率为18.86%。因此，在保证甜菊糖提取率的前提下，利用超声波辅助纤维素酶提取甜叶菊中的甜菊糖的提取更为高效。
甜菊糖对4种供试菌均表现出一定的抑制作用，对各供试菌的抑菌性大小为大肠杆菌>枯草芽孢杆菌、毛霉>根霉。当甜菊糖浓度较高时，对细菌的抑制效果比霉菌更顯著;当甜菊糖浓度较低时，对霉菌的抑制效果比细菌更显著。其中，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉、根霉的最小抑菌浓度（MIC）分别为20、40、10、80mg/mL。
参考文献
[1]赵秀玲.我国甜味剂甜菊糖苷发展状况[J].中国调味品，2009，34（05）：110-113.
[2]刘贵君，石浩.甜菊糖的应用研究进展[J].浙江化工，2016，47（11）：34-41.
[3]陈育如，杨凤平，杨帆，等.甜叶菊及甜菊糖的多效功能与保健应用[J].南京师大学报（自然科学版），2016，39（02）：56-60.
[4]杨洋，李启明，高航，等.甜菊糖苷功能特性与应用现状[J].食品工业，2018，39（11）：270-272.
[5]张丽娜，于涛，高冷.从甜菊叶中提取和精制甜菊苷的工艺研究[J].中国调味品，2008（01）：58-59，64.
[6]王永祥，祁斌，何唯东，等.溶剂法提取甜叶菊甙（Ⅰ）[J].杭州师院学报（自然科学版），1984（S1）：24-25.
[7]郁军，岳鹏翔，郁红，等.三级逆流法提取甜菊糖甙的工艺研究[J].食品科学，2009，30（02）：146-148.
[8]万水昌，王志祥，乐龙，等.超声提取技术在中药及天然产物提取中的应用[J].西北药学杂志，2008（01）：60-62.
[9]黄琼，何燕萍.超声波辅助提取玫瑰茄多糖工艺研究[J].食品研究与开发，2019，40（05）：123-127.
[10]王雨东.虫草多糖酶提取及纯化工艺研究和优化[D].上海：华东理工大学，2017.
[11]黎英，陈雪梅，严月萍，等.超声波辅助酶法提取红腰豆多糖工艺优化[J].农业工程学报，2015，31（15）：293-301.
[12]孟宪军，刘晓晶，孙希云，等.蓝莓多糖的抗氧化性与抑菌作用[J].食品科学，2010，31（17）：110-114.
[13]孙义玄，包怡红.艾蒿多糖抑菌活性及稳定性[J].食品与生物技术学报，2017，36（09）：990-995.
（责编：张宏民）