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摘要 [目的]研究不同产地5种柑橘皮中总黄酮含量。[方法]采用紫外分光光度法测定5种柑橘皮中总黄酮的含量，并对此方法进行精密度、稳定性、重复性和加样回收率等结果的考察。[结果]5种柑橘皮中总黄酮含量最高的是脐橙，其含量是2.53%，其次是柳橙和丑柑，分别是2.24%和1.82%，含量较低的是血橙和广柑，分别是1.48%和1.27%，方法学考察结果认为该方法是一种简单稳定、重复性好的测定方法。[结论]该研究为柑橘皮中黄酮的提取利用提供一定的理论基础。
关键词 紫外可见分光光度法;柑橘皮;总黄酮;含量
Abstract [Objective]The research aimed to study the total flavonoids content in five kinds of citrus peels from different producing areas.[Method]The content of total flavonoids in five kinds of citrus peels was determined by UVVisible spectrophotometry，and the method was investigated for precision，stability，repeatability and sample recovery.[Result]The highest content of total flavonoids in the five citrus peels was Citrus sinensis Osbeck，its content was 2.53%，followed by Citrus sinensis （L.） Osbeck cv.Liu Cheng and Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan at 2.24%and 1.82%，respectively.The lower content was Citrus sinensis Doublefine Ameliorée and Citrus sinensis （L.） Osbeck，which were 1.48% and 1.27%，the methodological investigation results confirmed that the method was a simple and stable repeatability measurement method.[Conclusion]This study provides a certain theoretical basis for the extraction and utilization of total flavonoids in citrus peel.
Key words UVVisible spectrophotometry;Citrus peel;Total flavonoids;Content
柑橘属于芸香科柑橘亚科植物，我国拥有丰富的柑橘资源，作为南方主要的水果之一，我国栽培面积为世界第一，产量占世界第三，仅次于巴西和美国[1-2]。柑橘皮作为柑橘加工的主要副产物，占整个果重的25%～40%，含有精油、色素、果胶、黄酮类化合物等多种可提取利用的成分[2]。柑橘皮作为传统的中药，其黄酮类物质含量丰富，主要包括黄烷酮、黄酮和多甲氧基黄酮3类物质[3]，主要以黄烷酮苷为主。有研究表明，柑橘黄酮具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂及增强免疫力活性等作用[4-5]。该研究主要利用紫外分光光度法[6]，对来自不同产地的脐橙Citrus sinensis Osbeck（江西省赣南市）、丑柑Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan（四川省自贡市）、血橙Citrus sinensis Doublefine Ameliorée（四川省宜宾市）、广柑Citrus sinensis（L.） Osbeck（重庆市开县）、柳橙Citrus sinensis（L.） Osbeck cv.Liu Cheng （广西省柳州市）5种不同品种柑橘皮中总黄酮含量进行测定和比较，为全面开发和利用柑橘皮资源提供一定的试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。
脐橙、丑柑、血橙、广柑、柳橙，所有材料均购于当地农贸市场。
1.1.2 主要试剂。
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，100080-200707）;无水乙醇（四川西陇化工有限公司）;亚硝酸钠（无锡市亚泰联合化工有限公司，批号20180301）;硝酸铝（北京康普汇维科技有限公司，批号20101001）;氢氧化钠（上海国药集团化学试剂有点公司，批号20171210）;所有试剂均为分析纯。
1.1.3 主要仪器。
可见光分光光度计（日立 U-3010）;电热鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）;研钵（成都典锐实验仪器有限公司）;电子天平（美国OHAUS Corp）;离心机（上海安亭科学仪器厂）;抽滤装置（上海领德仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 供试品溶液的制备[7-8]。
将新鲜柑橘皮切成细丝，分别装入贴有标签的1～5号烧杯中，放入80 ℃干燥箱烘干至恒重，钵磨成粉末。精确称取各烧杯中干粉约1.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入70%乙醇至30 mL，浸泡24 h后过滤，滤液用70%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到黄酮提取液。
1.2.2 标准品溶液的制备。精密称取100 ℃干燥至恒重的芦丁对照品5 mg，加入70%乙醇溶解后置于25 mL容量瓶中，加水定容，即得0.2 mg/mL蘆丁对照品溶液。 1.2.3 溶液显色。
精密量取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，先加入5%NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL摇匀，静置6 min，最后加入4%NaOH溶液4.0 mL后，加水至容量瓶刻度线并摇匀放置15 min，以纯水加相应试剂为空白对照组，等待检测。
1.2.4 测定波长的确定。按照“1.2.3”的显色方法，分别对照品溶液、供试品溶液和空白对照液（超纯水）显色后，于1 cm比色皿中，在200～800 nm波长进行扫描，发现对照品和样品溶液均显示在510 nm处有最大吸收峰，因此选定510 nm作为测定波长。
1.2.5 标准曲线的绘制。分别准确移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准品溶液于10 mL容量瓶中，以纯水为空白对照，按照“1.2.3”中方法显色后，于510 nm波长下迅速测定其余几组吸光度，以芦丁标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。
1.2.6 总黄酮含量的测定[7-8]。精密量取各供试品溶液1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，空白组加入1.0 mL超纯水，按照“1.2.3”中方法显色后，以空白组为对照，迅速测出供试品溶液在510 nm吸光度的平均值，从线性相关方程计算出相应的黄酮浓度C，再换算成提取液中总黄酮的质量，计算总黄酮含量（X），其公式如下：
其中，C是根据标准曲线拟合方程计算，单位为g/L;V为黄酮提取液总体积（mL）。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线 以芦丁标准品浓度C为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程为Y=1.338 9X+0.025 9（R2=0.996 1），结果表明芦丁含量在0.2～1.2 mg/mL呈良好的线性关系（图1）。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度试验。
精密吸取对照品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按照“1.2.3”中方法显色后，依次重复测定6次，结果显示RSD为0.17%（n=6），说明仪器精密度良好。
2.2.2 稳定性试验。精密吸取脐橙溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按照“1.2.3”中方法显色后，每间隔5 min测定一次，依次测定6次至30 min，RSD为1.30%（n=6），说明供试品溶液在30 min内稳定性良好。
2.2.3 重复性试验。取同一样品脐橙5份，按“1.2.1”方法制备5份供试品溶液，精密吸取2.0 mL于具塞试管中，按照“1.2.3”中方法显色后，依次测定吸光度，结果发现平均含量为2.53%，RSD为1.5%（n=5），表明该方法重复性良好。
2.2.4 加样回收试验。
精密量取6份已知浓度（0.147 9 mg/mL）血橙样品黄酮提取液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，分成3组分别加入1.0、2.0、4.0 mL标准品溶液，摇匀，按照“1.2.3”中方法显色后，测定510 nm吸光度，计算出加样回收率平均值为99.88%，RSD为1.31%，说明该方法合理可行，可以用于总黄酮含量的测定（表 1）。
2.3 不同品种柑橘皮中总黄酮含量比较 根据“1.2.6”中公式（1）计算出5种柑橘皮中总黄酮含量最高的是脐橙，其含量为2.53%，其次是柳橙和丑柑，分别是2.24%和1.82%，含量较低的是血橙和广柑，分别是1.48%和1.27%;5种柑橘皮中总黄酮含量差距较小，但含量普遍偏低（图2）。
3 结论与讨论
目前，对于总黄酮含量的测定大部分是选用芦丁作為标准品，并采用分光光度法进行测定，大量研究表明该方法擦作简单、测定结果准确且具有良好的重复性[9-10]。因此该研究以5种不同产地柑橘皮为研究对象，采用分光光度法测定其中总黄酮含量，结果表明不同种类柑橘皮中总黄酮含量均有差异，5种柑橘皮中总黄酮含量最高的是脐橙，其含量是2.53%，其次是柳橙和丑柑，分别是2.24%和1.82%。方法学考察的结果也表明该方法稳定性强、重复性好、回收率高，可以用于柑橘皮中总黄酮含量的测定，通过对不同品种柑橘皮中总黄酮含量的比较研究，可以为柑橘皮中黄酮的提取利用提供理论基础，同时也为柑橘皮的综合开发奠定试验基础。
参考文献
[1] 李敏，何亚萍，柴娟，等.柑橘皮总黄酮的提取及抗氧化性研究[J].应用化工，2016，45（3）：501-503.
[2] 徐旭耀.柑橘中黄酮类物质和维生素C的测定方法研究[D].长沙：湖南大学，2011.
[3] 吴梅青，李俊雅，陈丹.柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的试验研究[J].食品研究与开发，2018，39（5）：56-59.
[4] 陈婵，丁玲，彭宏，等.不同方法提取柚皮总黄酮含量的比较研究[J].江西农业学报，2015，27（5）：75-78.
[5] 张明霞，杨天佑，冯卫华.柑橘属植物类黄酮研究进展[J].河南科技学院学报，2014，42（5）：11-15.
[6] 张冬冬，徐迪，洪伟.超声提取柑橘皮中总黄酮的研究[J].农产品加工，2017（10）：1-3.
[7] 金晶，罗爱民，杨艳，等.橘皮中黄酮类化合物的提取工艺及抗氧化性研究[J] .湖北民族学院学报（自然科学版），2014，32（3）：276-281.
[8] 季露，郎娅，裘迪红，等.不同柑橘品种果汁中抗氧化成分比较[J].宁波大学学报（理工版），2016，29（4）：20-25.
[9] 陈凤清，张紫瑶，郑长新，等.丑橘皮总黄酮的提取工艺及抑菌活性研究[J].中国农机化学报，2017，38（1）：68-73.
[10] 卫娜，徐勇，袁娟，等.柑橘中提取的柑橘黄酮调节高脂血症的研究[J].食品与发酵科技，2016， 50（5）：5-8，71.
关键词 紫外可见分光光度法;柑橘皮;总黄酮;含量
Abstract [Objective]The research aimed to study the total flavonoids content in five kinds of citrus peels from different producing areas.[Method]The content of total flavonoids in five kinds of citrus peels was determined by UVVisible spectrophotometry，and the method was investigated for precision，stability，repeatability and sample recovery.[Result]The highest content of total flavonoids in the five citrus peels was Citrus sinensis Osbeck，its content was 2.53%，followed by Citrus sinensis （L.） Osbeck cv.Liu Cheng and Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan at 2.24%and 1.82%，respectively.The lower content was Citrus sinensis Doublefine Ameliorée and Citrus sinensis （L.） Osbeck，which were 1.48% and 1.27%，the methodological investigation results confirmed that the method was a simple and stable repeatability measurement method.[Conclusion]This study provides a certain theoretical basis for the extraction and utilization of total flavonoids in citrus peel.
Key words UVVisible spectrophotometry;Citrus peel;Total flavonoids;Content
柑橘属于芸香科柑橘亚科植物，我国拥有丰富的柑橘资源，作为南方主要的水果之一，我国栽培面积为世界第一，产量占世界第三，仅次于巴西和美国[1-2]。柑橘皮作为柑橘加工的主要副产物，占整个果重的25%～40%，含有精油、色素、果胶、黄酮类化合物等多种可提取利用的成分[2]。柑橘皮作为传统的中药，其黄酮类物质含量丰富，主要包括黄烷酮、黄酮和多甲氧基黄酮3类物质[3]，主要以黄烷酮苷为主。有研究表明，柑橘黄酮具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂及增强免疫力活性等作用[4-5]。该研究主要利用紫外分光光度法[6]，对来自不同产地的脐橙Citrus sinensis Osbeck（江西省赣南市）、丑柑Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan（四川省自贡市）、血橙Citrus sinensis Doublefine Ameliorée（四川省宜宾市）、广柑Citrus sinensis（L.） Osbeck（重庆市开县）、柳橙Citrus sinensis（L.） Osbeck cv.Liu Cheng （广西省柳州市）5种不同品种柑橘皮中总黄酮含量进行测定和比较，为全面开发和利用柑橘皮资源提供一定的试验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 研究对象。
脐橙、丑柑、血橙、广柑、柳橙，所有材料均购于当地农贸市场。
1.1.2 主要试剂。
芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，100080-200707）;无水乙醇（四川西陇化工有限公司）;亚硝酸钠（无锡市亚泰联合化工有限公司，批号20180301）;硝酸铝（北京康普汇维科技有限公司，批号20101001）;氢氧化钠（上海国药集团化学试剂有点公司，批号20171210）;所有试剂均为分析纯。
1.1.3 主要仪器。
可见光分光光度计（日立 U-3010）;电热鼓风干燥箱（上海森信实验仪器有限公司）;研钵（成都典锐实验仪器有限公司）;电子天平（美国OHAUS Corp）;离心机（上海安亭科学仪器厂）;抽滤装置（上海领德仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 供试品溶液的制备[7-8]。
将新鲜柑橘皮切成细丝，分别装入贴有标签的1～5号烧杯中，放入80 ℃干燥箱烘干至恒重，钵磨成粉末。精确称取各烧杯中干粉约1.0 g，置于100 mL容量瓶中，加入70%乙醇至30 mL，浸泡24 h后过滤，滤液用70%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得到黄酮提取液。
1.2.2 标准品溶液的制备。精密称取100 ℃干燥至恒重的芦丁对照品5 mg，加入70%乙醇溶解后置于25 mL容量瓶中，加水定容，即得0.2 mg/mL蘆丁对照品溶液。 1.2.3 溶液显色。
精密量取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，先加入5%NaNO2溶液0.4 mL，摇匀，静置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液0.4 mL摇匀，静置6 min，最后加入4%NaOH溶液4.0 mL后，加水至容量瓶刻度线并摇匀放置15 min，以纯水加相应试剂为空白对照组，等待检测。
1.2.4 测定波长的确定。按照“1.2.3”的显色方法，分别对照品溶液、供试品溶液和空白对照液（超纯水）显色后，于1 cm比色皿中，在200～800 nm波长进行扫描，发现对照品和样品溶液均显示在510 nm处有最大吸收峰，因此选定510 nm作为测定波长。
1.2.5 标准曲线的绘制。分别准确移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准品溶液于10 mL容量瓶中，以纯水为空白对照，按照“1.2.3”中方法显色后，于510 nm波长下迅速测定其余几组吸光度，以芦丁标准品浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归。
1.2.6 总黄酮含量的测定[7-8]。精密量取各供试品溶液1.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，空白组加入1.0 mL超纯水，按照“1.2.3”中方法显色后，以空白组为对照，迅速测出供试品溶液在510 nm吸光度的平均值，从线性相关方程计算出相应的黄酮浓度C，再换算成提取液中总黄酮的质量，计算总黄酮含量（X），其公式如下：
其中，C是根据标准曲线拟合方程计算，单位为g/L;V为黄酮提取液总体积（mL）。
2 结果与分析
2.1 芦丁标准曲线 以芦丁标准品浓度C为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程为Y=1.338 9X+0.025 9（R2=0.996 1），结果表明芦丁含量在0.2～1.2 mg/mL呈良好的线性关系（图1）。
2.2 方法学考察
2.2.1 精密度试验。
精密吸取对照品溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按照“1.2.3”中方法显色后，依次重复测定6次，结果显示RSD为0.17%（n=6），说明仪器精密度良好。
2.2.2 稳定性试验。精密吸取脐橙溶液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按照“1.2.3”中方法显色后，每间隔5 min测定一次，依次测定6次至30 min，RSD为1.30%（n=6），说明供试品溶液在30 min内稳定性良好。
2.2.3 重复性试验。取同一样品脐橙5份，按“1.2.1”方法制备5份供试品溶液，精密吸取2.0 mL于具塞试管中，按照“1.2.3”中方法显色后，依次测定吸光度，结果发现平均含量为2.53%，RSD为1.5%（n=5），表明该方法重复性良好。
2.2.4 加样回收试验。
精密量取6份已知浓度（0.147 9 mg/mL）血橙样品黄酮提取液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，分成3组分别加入1.0、2.0、4.0 mL标准品溶液，摇匀，按照“1.2.3”中方法显色后，测定510 nm吸光度，计算出加样回收率平均值为99.88%，RSD为1.31%，说明该方法合理可行，可以用于总黄酮含量的测定（表 1）。
2.3 不同品种柑橘皮中总黄酮含量比较 根据“1.2.6”中公式（1）计算出5种柑橘皮中总黄酮含量最高的是脐橙，其含量为2.53%，其次是柳橙和丑柑，分别是2.24%和1.82%，含量较低的是血橙和广柑，分别是1.48%和1.27%;5种柑橘皮中总黄酮含量差距较小，但含量普遍偏低（图2）。
3 结论与讨论
目前，对于总黄酮含量的测定大部分是选用芦丁作為标准品，并采用分光光度法进行测定，大量研究表明该方法擦作简单、测定结果准确且具有良好的重复性[9-10]。因此该研究以5种不同产地柑橘皮为研究对象，采用分光光度法测定其中总黄酮含量，结果表明不同种类柑橘皮中总黄酮含量均有差异，5种柑橘皮中总黄酮含量最高的是脐橙，其含量是2.53%，其次是柳橙和丑柑，分别是2.24%和1.82%。方法学考察的结果也表明该方法稳定性强、重复性好、回收率高，可以用于柑橘皮中总黄酮含量的测定，通过对不同品种柑橘皮中总黄酮含量的比较研究，可以为柑橘皮中黄酮的提取利用提供理论基础，同时也为柑橘皮的综合开发奠定试验基础。
参考文献
[1] 李敏，何亚萍，柴娟，等.柑橘皮总黄酮的提取及抗氧化性研究[J].应用化工，2016，45（3）：501-503.
[2] 徐旭耀.柑橘中黄酮类物质和维生素C的测定方法研究[D].长沙：湖南大学，2011.
[3] 吴梅青，李俊雅，陈丹.柑橘皮中总黄酮提取工艺及降血糖活性的试验研究[J].食品研究与开发，2018，39（5）：56-59.
[4] 陈婵，丁玲，彭宏，等.不同方法提取柚皮总黄酮含量的比较研究[J].江西农业学报，2015，27（5）：75-78.
[5] 张明霞，杨天佑，冯卫华.柑橘属植物类黄酮研究进展[J].河南科技学院学报，2014，42（5）：11-15.
[6] 张冬冬，徐迪，洪伟.超声提取柑橘皮中总黄酮的研究[J].农产品加工，2017（10）：1-3.
[7] 金晶，罗爱民，杨艳，等.橘皮中黄酮类化合物的提取工艺及抗氧化性研究[J] .湖北民族学院学报（自然科学版），2014，32（3）：276-281.
[8] 季露，郎娅，裘迪红，等.不同柑橘品种果汁中抗氧化成分比较[J].宁波大学学报（理工版），2016，29（4）：20-25.
[9] 陈凤清，张紫瑶，郑长新，等.丑橘皮总黄酮的提取工艺及抑菌活性研究[J].中国农机化学报，2017，38（1）：68-73.
[10] 卫娜，徐勇，袁娟，等.柑橘中提取的柑橘黄酮调节高脂血症的研究[J].食品与发酵科技，2016， 50（5）：5-8，71.