论文部分内容阅读
摘要 对97份来自CIMMYT的人工合成小麦新种质进行了主要农艺性状考察、Yr18分子检测和成株期田间抗锈性接种鉴定。结果表明：参鉴种质间主要农艺性状变异程度较大，尤其千粒重普遍偏高，有30份材料千粒重达50 g以上、占30.9％；利用csLV34标记检测到合成20和合成43携带Yr18，占2.1％；鉴选出成株期呈抗性反应的材料30份、占30.9％，高度慢条锈材料19份、占19.6％，其中合成2、5、14、60、75、76、78、82、83、84计10个合成种同时表现高抗和高度慢锈。这些大粒、抗条锈或慢条锈合成小麦种质的鉴定筛选，为选育小麦新品种提供了优异资源。
关键词 合成小麦新种质； 农艺性状； csLV34； 抗条锈性鉴定
中图分类号S 435.121.42
小麦条锈病(Puccinia striiformis f.sp.triti—ci)是一种气传真菌病害，广泛分布于世界各主要产麦区，也是威胁我国西北、华北、长江中下游和西南各省、自治区小麦生产的重要病害之一，轻则减产10％～20％，重则减产40％～60％，甚至绝收。为此，前人通过杂交法、非整倍体法及现代分子生物学技术研究了小麦抗条锈遗传规律，确定了小麦所含抗条锈基因(Yr)的数目及性质，其中公认的慢条锈基因Yr18被定位在7D染色体短臂上。尽管上述研究为小麦抗条锈育种提供了科技支撑，但由于现代六倍体小麦不仅在其诞生过程中存在遗传背景狭窄的一面，而且在人工选择的压力下其遗传多样性有降低趋势，仅依靠现有种质资源很难解决包括条锈病在内的各种生理胁迫问题。
硬粒小麦(Triticum durum，2n=28，AABB)和节节麦(Aegilops tauschii，2n=14，DD)是六倍体普通小麦(T.aestivum，2n=42，AABBDD)的初级基因库，以其杂交而成的人工合成六倍体小麦(synthetic hexaploid wheat)具有遗传多样性高、抗条锈、抗穗发芽等特点，已成为利用野生祖先种优良基因的桥梁资源，被CIMMYT及其他许多国家用于改良小麦品种，对提高产量、改善品质、增强抗逆性有很大潜力。我国20世纪90年代从CIM—MYT引进了大量的人工合成六倍体小麦，在抗病性、HMW-GS组成、加工品质等方面进行了研究利用，其中四川省农业科学院以CIMMYT人工合成种为亲本，育成的川麦38、川麦42、川麦47、川麦107等系列品种表现出高产、优质和高抗条锈病等特点，已开始大面积推广；甘肃省农科院对其HMW-GS组成进行了分析，选择含1.5 10、5 12亚基的材料与普通小麦配制杂交组合，试图改良普通小麦的品质，已初见成效。但有关人工合成小麦种质主要农艺性状表现、抗条锈性鉴定，尤其对其是否携带Yrl8基因的研究报道在国内较少，影响了该种质的广泛利用。鉴于此，作者于2006—2007年设置试验，对97份CIMMYT人工合成小麦新种质的主要农艺性状及抗条锈性进行了鉴定，并利用csLV34标记检测Yr18基因，旨在进一步了解合成种质的特征特性，减少实际应用中的盲目性，为小麦新品种选育提供优异种质资源。
1 材料与方法
1．1 供试材料
供试种质为来自CIMMYT的97份硬粒小麦一节节麦人工合成六倍体小麦(表2)。将2006年进行农艺性状鉴定时收获的种子分成两部分，一部分用于慢条锈基因Yr18的分子检测，另一部分于2007年种植在田间进行成株期抗条锈性鉴定。条锈菌混合菌源(条中32号、水14、水4、水5、水7等比例混合)由甘肃省农科院植物保护研究所提供。
1．2 主要农艺性状鉴定
2006年试验设在甘肃省农科院作物研究所兰州试验点，以宁春4号为对照，采用间比排列，2次重复，两行区，行长1.8 m，行距0.2 m，分别对供试种质的生育期、株高、穗长、小穗数、穗粒数、千粒重等性状进行了考察记载。
1．3 Yr18基因鉴定
1．3．1 DNA提取
采用CTAB法提取小麦基因组DNA。利用紫外分光光度计检测DNA浓度，终浓度调整至50 ng/μL。
1．3．2 Yr18分子检测
Yr18特异性引物csLV34来源于Lagudah等文献，由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列上游引物：5’-GTTGGTTAAGACTGGTGAT—GG-3’；下游引物：5’-TGCTTGCTATTGCT—GAATAGT-3’。
PCR反应体系为：20 μL总体积中含有1×buffer(50 mmol/L KCl，10 mmol/LTris-C1，1.5 mmol/LMgCl2，pH 8.0)，TaKeRa DNA聚合酶1U，dNTP各200 gmol/L，每条引物5pmol，模板DNA50 ng。
PCR反应条件为：首先94℃5 min；然后94℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，38个循环；最后72℃延伸7 min。
扩增产物以2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲体系为1×TAE溶液，100 V电压电泳80 min，溴化乙锭染色后，用MultiGenius Gel Doc—umentation and Analysis System扫描成像并存入计算机。
1．4 成株期抗条锈性鉴定
1．4．1 试验设计与接种方法
试验于2007年设在甘肃省农科院作物研究所兰州试验点，供试材料单行种植，行长1.8 m，行距0.2 m，以快锈品种铭贤169作对照和诱发行。于小麦挑旗期接种，按1.0 g条锈菌加0.05％吐温溶液500 mL配成孢子悬浮液，均匀喷雾接种于参鉴材料上，接菌后加盖塑料保湿15 h。
1．4．2 调查记载标准
待对照品种铭贤169充分发病后，按照GB/T1579521995条锈病记载标准，每份供鉴种质随机抽样35株，调查记载其主茎旗叶和倒二叶的发病情况。反应型采用0、0；、1、2、3、4六级标准，其中0～2为抗病反应(R)，3～4为感病反应(S)；严重度按0、t％、5％、10％、25％、40％、65％、80％和100％的标准记载，分别统计各级叶片数，用加权法求其平均严重度，根据袁文焕对慢锈性的划分标准，将参试种质划分为高度慢锈性类型(严重度＜10％)、中度慢锈性类型(严重度11％～25％)、低度慢锈型类型(严重度26％～40％)、中度感锈类型(严重度41％～80％)、高度感锈类型(严重度81％～90％)；普遍率为发病叶片数占调查叶片数的百分比。
2 结果与分析
2．1 主要农艺性状观测
将供试种质的生育期、株高、穗长、小穗数、穗粒 数、千粒重的平均值、变幅和变异系数列于表1。从表1可以看出，被考查的6个性状变异程度均较大，说明人工合成小麦新种质中蕴藏了丰富的遗传基因，具有广阔的开发利用前景。97份供试种质与甘肃省当前大面积应用品种宁春4号(CK)相比，表现早熟的仅1份(合成24)、株高低的有23份、穗长长的有46份、小穗数多的有6份、千粒重高的达87份，但穗粒数均少于对照。值得一提的是千粒重在50 g以上的种质有30份、占30.9％，若用这些合成种质改良普通小麦品种，将对增加千粒重、提高产量水平发挥重要作用。
2．3 成株期抗条锈性表现
2007年小麦条锈病在甘肃呈现显病时间早、发病范围广、危害程度重的特点，属大流行年份，这种环境有助于准确鉴定人工合成小麦的抗条锈性。本试验成株期田间接种鉴定结果表明，97份参鉴种质间发病程度各异，但其病情指数均低于感病对照铭贤169。从反应型看，有30份材料表现抗病反应、67份材料表现感病反应，分别占30.93％和69.07％，其中合成2、5、14、40、60、75、76、78、82、83、84等11个品种为高抗以上反应。从严重度看，有19个种质表现高度慢锈、占19.59％，19个种质表现中度慢锈、占19.59％，18个种质表现低度慢锈、占18.56％，41个种质表现中度感锈、占42.26％，表现高度慢锈的19个种质为合成1、2、3、4、5、8、14、20、27、33、35、59、60、75、76、78、82、83、84。
综上所述，合成2、5、14、60、75、76、78、82、83、84等10个人工合成小麦新种质，可作为普通小麦抗锈或慢锈育种的亲缘材料加以利用。
3 结论与讨论
在参试的97份CIMMYT人工合成小麦新种质中，种质问主要农艺性状变异程度较大，平均生育期偏晚、株偏高、小穗数和穗粒数偏少，但千粒重普遍较大，有30份材料千粒重达50 g以上；经csLV34标记检测，有2份材料含有Yr18慢条锈基因；成株期条锈性呈抗性反应的材料有30份，高度慢锈材料19份。了解合成种质的特征特性对改良普通小麦品种有指导意义。
虽然目前已经证明的慢条锈基因有Yr18、Yr29和Yr30，但小麦品种的慢条锈性是很复杂的，很少由单个基因控制，多数是数量性状，是多个微效基因共同作用的结果。即使公认的慢条锈基因Yr18，当其单独存在时，它控制的抗性水平也往往很低，当Yr18和2～4个具有加性效应的微效基因结合在一起时能产生较高水平的抗性且能持久。本试验利用csLV84标记检测到合成20、合成43均携带慢条基因Yr18，但两种质成株期抗条锈性差异较大，合成20表现为2型反应，严重度仅8.5％，而合成43为3型反应，严重度达39％。这可能是两种质所含加性微效基因的数目不同所致，有待进一步进行遗传分析。
迄今为止国内外共发现命名了37个抗条锈病主效基因位点，本文仅对Yr18基因在97份合成种质中的分布情况进行了检测。而成株期田间抗条锈性接种鉴定结果表明，有30份材料呈现抗性反应，其中11份材料表现高抗以上，很可能这些材料中含有其他抗条锈主效基因，可作为抗锈育种的亲本资源加以开发利用。
csLV34为共显性标记，准确性高，重复性好，可用于慢条锈性基因Yr18的分子标记辅助选育。
关键词 合成小麦新种质； 农艺性状； csLV34； 抗条锈性鉴定
中图分类号S 435.121.42
小麦条锈病(Puccinia striiformis f.sp.triti—ci)是一种气传真菌病害，广泛分布于世界各主要产麦区，也是威胁我国西北、华北、长江中下游和西南各省、自治区小麦生产的重要病害之一，轻则减产10％～20％，重则减产40％～60％，甚至绝收。为此，前人通过杂交法、非整倍体法及现代分子生物学技术研究了小麦抗条锈遗传规律，确定了小麦所含抗条锈基因(Yr)的数目及性质，其中公认的慢条锈基因Yr18被定位在7D染色体短臂上。尽管上述研究为小麦抗条锈育种提供了科技支撑，但由于现代六倍体小麦不仅在其诞生过程中存在遗传背景狭窄的一面，而且在人工选择的压力下其遗传多样性有降低趋势，仅依靠现有种质资源很难解决包括条锈病在内的各种生理胁迫问题。
硬粒小麦(Triticum durum，2n=28，AABB)和节节麦(Aegilops tauschii，2n=14，DD)是六倍体普通小麦(T.aestivum，2n=42，AABBDD)的初级基因库，以其杂交而成的人工合成六倍体小麦(synthetic hexaploid wheat)具有遗传多样性高、抗条锈、抗穗发芽等特点，已成为利用野生祖先种优良基因的桥梁资源，被CIMMYT及其他许多国家用于改良小麦品种，对提高产量、改善品质、增强抗逆性有很大潜力。我国20世纪90年代从CIM—MYT引进了大量的人工合成六倍体小麦，在抗病性、HMW-GS组成、加工品质等方面进行了研究利用，其中四川省农业科学院以CIMMYT人工合成种为亲本，育成的川麦38、川麦42、川麦47、川麦107等系列品种表现出高产、优质和高抗条锈病等特点，已开始大面积推广；甘肃省农科院对其HMW-GS组成进行了分析，选择含1.5 10、5 12亚基的材料与普通小麦配制杂交组合，试图改良普通小麦的品质，已初见成效。但有关人工合成小麦种质主要农艺性状表现、抗条锈性鉴定，尤其对其是否携带Yrl8基因的研究报道在国内较少，影响了该种质的广泛利用。鉴于此，作者于2006—2007年设置试验，对97份CIMMYT人工合成小麦新种质的主要农艺性状及抗条锈性进行了鉴定，并利用csLV34标记检测Yr18基因，旨在进一步了解合成种质的特征特性，减少实际应用中的盲目性，为小麦新品种选育提供优异种质资源。
1 材料与方法
1．1 供试材料
供试种质为来自CIMMYT的97份硬粒小麦一节节麦人工合成六倍体小麦(表2)。将2006年进行农艺性状鉴定时收获的种子分成两部分，一部分用于慢条锈基因Yr18的分子检测，另一部分于2007年种植在田间进行成株期抗条锈性鉴定。条锈菌混合菌源(条中32号、水14、水4、水5、水7等比例混合)由甘肃省农科院植物保护研究所提供。
1．2 主要农艺性状鉴定
2006年试验设在甘肃省农科院作物研究所兰州试验点，以宁春4号为对照，采用间比排列，2次重复，两行区，行长1.8 m，行距0.2 m，分别对供试种质的生育期、株高、穗长、小穗数、穗粒数、千粒重等性状进行了考察记载。
1．3 Yr18基因鉴定
1．3．1 DNA提取
采用CTAB法提取小麦基因组DNA。利用紫外分光光度计检测DNA浓度，终浓度调整至50 ng/μL。
1．3．2 Yr18分子检测
Yr18特异性引物csLV34来源于Lagudah等文献，由上海生工生物技术有限公司合成。引物序列上游引物：5’-GTTGGTTAAGACTGGTGAT—GG-3’；下游引物：5’-TGCTTGCTATTGCT—GAATAGT-3’。
PCR反应体系为：20 μL总体积中含有1×buffer(50 mmol/L KCl，10 mmol/LTris-C1，1.5 mmol/LMgCl2，pH 8.0)，TaKeRa DNA聚合酶1U，dNTP各200 gmol/L，每条引物5pmol，模板DNA50 ng。
PCR反应条件为：首先94℃5 min；然后94℃变性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，38个循环；最后72℃延伸7 min。
扩增产物以2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，缓冲体系为1×TAE溶液，100 V电压电泳80 min，溴化乙锭染色后，用MultiGenius Gel Doc—umentation and Analysis System扫描成像并存入计算机。
1．4 成株期抗条锈性鉴定
1．4．1 试验设计与接种方法
试验于2007年设在甘肃省农科院作物研究所兰州试验点，供试材料单行种植，行长1.8 m，行距0.2 m，以快锈品种铭贤169作对照和诱发行。于小麦挑旗期接种，按1.0 g条锈菌加0.05％吐温溶液500 mL配成孢子悬浮液，均匀喷雾接种于参鉴材料上，接菌后加盖塑料保湿15 h。
1．4．2 调查记载标准
待对照品种铭贤169充分发病后，按照GB/T1579521995条锈病记载标准，每份供鉴种质随机抽样35株，调查记载其主茎旗叶和倒二叶的发病情况。反应型采用0、0；、1、2、3、4六级标准，其中0～2为抗病反应(R)，3～4为感病反应(S)；严重度按0、t％、5％、10％、25％、40％、65％、80％和100％的标准记载，分别统计各级叶片数，用加权法求其平均严重度，根据袁文焕对慢锈性的划分标准，将参试种质划分为高度慢锈性类型(严重度＜10％)、中度慢锈性类型(严重度11％～25％)、低度慢锈型类型(严重度26％～40％)、中度感锈类型(严重度41％～80％)、高度感锈类型(严重度81％～90％)；普遍率为发病叶片数占调查叶片数的百分比。
2 结果与分析
2．1 主要农艺性状观测
将供试种质的生育期、株高、穗长、小穗数、穗粒 数、千粒重的平均值、变幅和变异系数列于表1。从表1可以看出，被考查的6个性状变异程度均较大，说明人工合成小麦新种质中蕴藏了丰富的遗传基因，具有广阔的开发利用前景。97份供试种质与甘肃省当前大面积应用品种宁春4号(CK)相比，表现早熟的仅1份(合成24)、株高低的有23份、穗长长的有46份、小穗数多的有6份、千粒重高的达87份，但穗粒数均少于对照。值得一提的是千粒重在50 g以上的种质有30份、占30.9％，若用这些合成种质改良普通小麦品种，将对增加千粒重、提高产量水平发挥重要作用。
2．3 成株期抗条锈性表现
2007年小麦条锈病在甘肃呈现显病时间早、发病范围广、危害程度重的特点，属大流行年份，这种环境有助于准确鉴定人工合成小麦的抗条锈性。本试验成株期田间接种鉴定结果表明，97份参鉴种质间发病程度各异，但其病情指数均低于感病对照铭贤169。从反应型看，有30份材料表现抗病反应、67份材料表现感病反应，分别占30.93％和69.07％，其中合成2、5、14、40、60、75、76、78、82、83、84等11个品种为高抗以上反应。从严重度看，有19个种质表现高度慢锈、占19.59％，19个种质表现中度慢锈、占19.59％，18个种质表现低度慢锈、占18.56％，41个种质表现中度感锈、占42.26％，表现高度慢锈的19个种质为合成1、2、3、4、5、8、14、20、27、33、35、59、60、75、76、78、82、83、84。
综上所述，合成2、5、14、60、75、76、78、82、83、84等10个人工合成小麦新种质，可作为普通小麦抗锈或慢锈育种的亲缘材料加以利用。
3 结论与讨论
在参试的97份CIMMYT人工合成小麦新种质中，种质问主要农艺性状变异程度较大，平均生育期偏晚、株偏高、小穗数和穗粒数偏少，但千粒重普遍较大，有30份材料千粒重达50 g以上；经csLV34标记检测，有2份材料含有Yr18慢条锈基因；成株期条锈性呈抗性反应的材料有30份，高度慢锈材料19份。了解合成种质的特征特性对改良普通小麦品种有指导意义。
虽然目前已经证明的慢条锈基因有Yr18、Yr29和Yr30，但小麦品种的慢条锈性是很复杂的，很少由单个基因控制，多数是数量性状，是多个微效基因共同作用的结果。即使公认的慢条锈基因Yr18，当其单独存在时，它控制的抗性水平也往往很低，当Yr18和2～4个具有加性效应的微效基因结合在一起时能产生较高水平的抗性且能持久。本试验利用csLV84标记检测到合成20、合成43均携带慢条基因Yr18，但两种质成株期抗条锈性差异较大，合成20表现为2型反应，严重度仅8.5％，而合成43为3型反应，严重度达39％。这可能是两种质所含加性微效基因的数目不同所致，有待进一步进行遗传分析。
迄今为止国内外共发现命名了37个抗条锈病主效基因位点，本文仅对Yr18基因在97份合成种质中的分布情况进行了检测。而成株期田间抗条锈性接种鉴定结果表明，有30份材料呈现抗性反应，其中11份材料表现高抗以上，很可能这些材料中含有其他抗条锈主效基因，可作为抗锈育种的亲本资源加以开发利用。
csLV34为共显性标记，准确性高，重复性好，可用于慢条锈性基因Yr18的分子标记辅助选育。