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摘要：目的 观察黄芪多糖对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化特性的影响，为开发有效而又低毒的分化诱导剂提供依据。方法 采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化无特定病原体级Wistar大鼠BMSCs。用噻唑蓝（MTT）法筛选出黄芪多糖的合适浓度，取F3代细胞，采用随机数字表法分为对照组和诱导组（神经诱导、成脂诱导、成骨诱导、软骨诱导），采用甲苯胺蓝染色、油红O染色、茜素红染色检测神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞表面特异性标记物。用Western Blot技术检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、脂蛋白酯酶（LPL）、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。分析黄芪多糖对F3代BMSCs向神经、脂肪、软骨和骨的诱导分化作用。结果 MTT显示，在1 g/L黄芪多糖诱导48 h下细胞增殖明显，甲苯胺蓝染色阳性，而油红O、茜素红染色阴性。Western Blot法检测显示NSE为阳性表达，LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ均为阴性表达。结论 黄芪多糖可诱导大鼠BMSCs定向分化为神经细胞，而未向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞分化。
关键词：骨髓间充质干细胞；黄芪多糖；分化特性；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0060-05
Abstract：Objective To investigate the effect of astragalus polysaccharides （APS） on the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） to neurones， adipocytes， osteoblasts and chondrocytes， and provide basis for the development of effective and low toxic differentiation inducing agents. Methods BMSCs were isolated from SPF Wistar rats， purified， expanded and cultured to family 3. The appropriate concentration of APS was filtered out by MTT assay. The F3 cells were randomly divided into control group and induced group （neural induction， adipogenic induction， osteogenic induction， cartilage induction）. The effects of APS and classical chemical drugs on differentiation were measured by toluidine blue， oil red o and alizarin red staining. The protein expression of NSE， LPL， collagen Ⅰ and collagen Ⅱ were examined by Western Blot. Results MTT assay showed that 1 g/L APS promoted the proliferation better than other concentrations especially in 48 hours. The morphologic change of the cell from BMSCs was uniformly positive to toluidine blue staining， and was negative to oil red o and alizarin red staining. Western blot showed that the protein expression of the cell from BMSCs was positive for NSE but negative for LPL， collagen Ⅰ and collagen Ⅱ. Conclusion BMSCs induced by APS can differentiate to neurone and fail to differentiate to adipocytes， osteoblasts and chondrocytes in vitro.
Key words：bone marrow mesenchymal stem cells；astragalus polysaccharides；differentiation characteristics；rats
骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源于中胚层，是一种具有自我更新能力及多向分化潜能的原始细胞，可被诱导分化为神经、肌肉、骨骼等200多种人体细胞、组织和器官[1]。目前，就干细胞分化而言，已有经典的化学方法体外诱导干细胞向其他细胞分化，但如β-巯基乙醇等化学诱导剂都有一定的毒性，不能用于人体。即BMSCs的分化诱导剂的安全性已成为广泛应用于临床前必须首先解决的问题。黄芪多糖是黄芪的主要生物活性成分，其可促进BMSCs的增殖[2]，但未见其促进BMSCs定向分化的适宜条件研究报道。本研究观察黄芪多糖对大鼠BMSCs向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的分化特性的影响，以期为开发有效而又低毒的BMSCs分化诱导剂提供实验依据。
1 实验材料 1.1 动物与细胞
SPF级Wistar大鼠，体质量（120±10）g，20只，雌雄皆用，购自甘肃中医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（甘）2004-2006-0002522号。采用全骨髓贴壁法提取大鼠原代BMSCs。
1.2 药物
黄芪购自甘肃省安宁医药公司，经甘肃中医学院中药制药中医药科研二级实验室鉴定为正品。粉碎，过20目筛，称量100 g，加入10倍量水，80 ℃下回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，浓缩后加入95%乙醇至含醇量为80%，静置过夜（4 ℃），过滤，分离沉淀，加入适量水溶解，加95%乙醇至含醇量为80%，再静置过夜（4 ℃），过滤，分离沉淀，加水溶解，除去蛋白（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V，共除20次），加活性炭脱色，抽滤，加95%乙醇至含醇量为80%，静置过夜（4 ℃），过滤，分离出沉淀，冷冻干燥，得多糖0.505 g，密封备用。
1.3 试剂
DMEM/F12培养基，Hyclone公司，批号NX20742；胎牛血清（FBS），Hyclone公司，批号NWl0509；胰蛋白酶，Gibco公司，批号20120708217；噻唑蓝（MTT），索莱宝科技有限公司，批号0793；二甲基亚砜（DMSO），索莱宝科技有限公司，批号0231；Western及IP细胞裂解液，碧云天生物技术研究所，批号P0013；BCA蛋白定量试剂盒，索莱宝公司，批号PC0020；3-甲基-1-异丁基黄嘌呤（IBMX），Sigma公司；转化生长因子-β2 （TGF-β2），peprotech公司；兔抗神经特异性烯醇化酶（NSE）抗体、兔抗胶原蛋白Ⅰ、兔抗胶原蛋白Ⅱ，北京博奥森；兔抗脂蛋白酯酶（LPL）抗体，武汉博士德生物工程有限公司；辣根酶标记山羊抗兔二抗，北京博奥森进口分装；小鼠抗β-actin单抗、辣根酶标记山羊抗小鼠二抗，北京中杉金桥。
1.4 仪器
蛋白核酸凝胶电泳转印系统，BIO-RAD公司，型号Mini Protean Tetra Cell Mini Trans-blot cell；电泳仪，BIO-RAD，型号PowerPac Universal；凝胶成像分析系统，BIO-RAD，型号ChemiDoc；二氧化碳培养箱，SANYO公司，型号MCO-18AIC（UV）；双人单面垂直送风超净工作台，天津市泰斯特仪器有限公司，型号CJ-2S；倒置荧光显微镜，OLYMPUS公司，型号IX81；酶标仪，BIO-RAD公司，型号iMark 1509。
2 实验方法
2.1 大鼠骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测
采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化BMSCs，并进行纯度鉴定[3]，流式细胞仪检测F3代大鼠BMSCs表面CD45-CD90+。
2.2 经典化学药物诱导大鼠骨髓间充质干细胞的定向分化
取F3代细胞，采用随机数字表法分为神经细胞诱导组（A组）及其对照组（B组）、脂肪细胞诱导组（C组）及其对照组（D组）、成骨细胞诱导组（E组）及其对照组（F组）、软骨细胞诱导组（G组）及其对照组（H组），每组3瓶，独立重复3次。A组每瓶加入含1 mmol/L β-巯基乙醇的培养液，B组各加完全DMEM/F12培养液。在诱导3、5 h时在镜下观察细胞形态变化，于5 h时进行甲苯胺蓝染色，随机计数A、B组8个非重叠视野（20倍）内染色阳性的细胞数，并计算阳性率（染色阳性细胞数/100×100%）。C组每瓶加入成脂诱导液（含1 μmoL/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmoL/L IBMX、0.1 mmoL/L吲哚美辛、10%FBS的DMEM/F12培养液），E组每瓶加入成骨诱导液（含0.1 μmoL/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、0.5 mmol/L β-甘油磷酸钠、10%FBS的DMEM/F12培养液），G组每瓶加入软骨诱导液（含TGF-β2 10 ng/mL、0.1 μmoL/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸的不含血清的L-DMEM诱导液）；D、F、H组各加完全DMEM/F12培养液。C、D、E、F、G、H组分别在诱导3、7、14、21 d时镜下观察细胞形态变化，21 d时C、D组进行油红O染色，阳性细胞内脂滴被染成红色，随机计数各8个非重叠视野（20倍）内染色阳性的细胞数，计算阳性率；E、F组进行茜素红染色；G、H组进行甲苯胺蓝染色。
2.3 MTT法检测骨髓间充质干细胞增殖
F3代BMSCs接种于2个96孔板内，每个培养板分为空白组、对照组和5个黄芪多糖组（浓度分别为0.25、0.5、1、2、4 g/L），每组5个复孔。培养24 h，每组各加100 μL含不同浓度黄芪多糖培养液。在24、48 h时各取1个培养板，每孔加入10 μL的MTT溶液，避光孵育4 h后，每孔加入150 μL的DMSO低速振荡10 min。全自动酶标仪测490 nm处吸光值。独立重复3次。
2.4 黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化
2.4.1 甲苯胺蓝、油红O、茜素红染色观察 取F3代细胞，采用随机数字表法分为诱导组和对照组，每组3瓶。细胞达到80%融合后，对照组加入完全培养液3 mL，诱导组加入含1 g/L黄芪多糖的完全培养液3 mL，培养48 h，分别进行甲苯胺蓝、油红O、茜素红染色，随机计数8个非重叠视野（20倍），计算阳性率。
2.4.2 Western Blot法检测相关蛋白 取F3代细胞，采用随机数字表法分为诱导组和对照组，每组4瓶。诱导组加入含1 g/L黄芪多糖的完全培养液3 mL，对照组加入完全培养液3 mL，培养48 h，提取细胞总蛋白后检测NSE、LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。加入RIPA缓冲液裂解细胞，测定蛋白质浓度。取50 μg蛋白量按比例与上样缓冲液混合，使终体积为20 μL，沸水浴煮沸5 min使蛋白充分变性。SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入1∶200倍稀释的兔抗NSE抗体、兔抗LPL抗体、兔抗胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ杂交2 h，TBST洗膜后加入1∶10 000倍稀释辣根酶标记山羊抗兔二抗，孵育1 h，TBST洗膜后进行ECL显色。
关键词：骨髓间充质干细胞；黄芪多糖；分化特性；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.020
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0060-05
Abstract：Objective To investigate the effect of astragalus polysaccharides （APS） on the differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） to neurones， adipocytes， osteoblasts and chondrocytes， and provide basis for the development of effective and low toxic differentiation inducing agents. Methods BMSCs were isolated from SPF Wistar rats， purified， expanded and cultured to family 3. The appropriate concentration of APS was filtered out by MTT assay. The F3 cells were randomly divided into control group and induced group （neural induction， adipogenic induction， osteogenic induction， cartilage induction）. The effects of APS and classical chemical drugs on differentiation were measured by toluidine blue， oil red o and alizarin red staining. The protein expression of NSE， LPL， collagen Ⅰ and collagen Ⅱ were examined by Western Blot. Results MTT assay showed that 1 g/L APS promoted the proliferation better than other concentrations especially in 48 hours. The morphologic change of the cell from BMSCs was uniformly positive to toluidine blue staining， and was negative to oil red o and alizarin red staining. Western blot showed that the protein expression of the cell from BMSCs was positive for NSE but negative for LPL， collagen Ⅰ and collagen Ⅱ. Conclusion BMSCs induced by APS can differentiate to neurone and fail to differentiate to adipocytes， osteoblasts and chondrocytes in vitro.
Key words：bone marrow mesenchymal stem cells；astragalus polysaccharides；differentiation characteristics；rats
骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源于中胚层，是一种具有自我更新能力及多向分化潜能的原始细胞，可被诱导分化为神经、肌肉、骨骼等200多种人体细胞、组织和器官[1]。目前，就干细胞分化而言，已有经典的化学方法体外诱导干细胞向其他细胞分化，但如β-巯基乙醇等化学诱导剂都有一定的毒性，不能用于人体。即BMSCs的分化诱导剂的安全性已成为广泛应用于临床前必须首先解决的问题。黄芪多糖是黄芪的主要生物活性成分，其可促进BMSCs的增殖[2]，但未见其促进BMSCs定向分化的适宜条件研究报道。本研究观察黄芪多糖对大鼠BMSCs向神经细胞、脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的分化特性的影响，以期为开发有效而又低毒的BMSCs分化诱导剂提供实验依据。
1 实验材料 1.1 动物与细胞
SPF级Wistar大鼠，体质量（120±10）g，20只，雌雄皆用，购自甘肃中医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（甘）2004-2006-0002522号。采用全骨髓贴壁法提取大鼠原代BMSCs。
1.2 药物
黄芪购自甘肃省安宁医药公司，经甘肃中医学院中药制药中医药科研二级实验室鉴定为正品。粉碎，过20目筛，称量100 g，加入10倍量水，80 ℃下回流提取3次，每次2 h，过滤，合并滤液，浓缩后加入95%乙醇至含醇量为80%，静置过夜（4 ℃），过滤，分离沉淀，加入适量水溶解，加95%乙醇至含醇量为80%，再静置过夜（4 ℃），过滤，分离沉淀，加水溶解，除去蛋白（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V，共除20次），加活性炭脱色，抽滤，加95%乙醇至含醇量为80%，静置过夜（4 ℃），过滤，分离出沉淀，冷冻干燥，得多糖0.505 g，密封备用。
1.3 试剂
DMEM/F12培养基，Hyclone公司，批号NX20742；胎牛血清（FBS），Hyclone公司，批号NWl0509；胰蛋白酶，Gibco公司，批号20120708217；噻唑蓝（MTT），索莱宝科技有限公司，批号0793；二甲基亚砜（DMSO），索莱宝科技有限公司，批号0231；Western及IP细胞裂解液，碧云天生物技术研究所，批号P0013；BCA蛋白定量试剂盒，索莱宝公司，批号PC0020；3-甲基-1-异丁基黄嘌呤（IBMX），Sigma公司；转化生长因子-β2 （TGF-β2），peprotech公司；兔抗神经特异性烯醇化酶（NSE）抗体、兔抗胶原蛋白Ⅰ、兔抗胶原蛋白Ⅱ，北京博奥森；兔抗脂蛋白酯酶（LPL）抗体，武汉博士德生物工程有限公司；辣根酶标记山羊抗兔二抗，北京博奥森进口分装；小鼠抗β-actin单抗、辣根酶标记山羊抗小鼠二抗，北京中杉金桥。
1.4 仪器
蛋白核酸凝胶电泳转印系统，BIO-RAD公司，型号Mini Protean Tetra Cell Mini Trans-blot cell；电泳仪，BIO-RAD，型号PowerPac Universal；凝胶成像分析系统，BIO-RAD，型号ChemiDoc；二氧化碳培养箱，SANYO公司，型号MCO-18AIC（UV）；双人单面垂直送风超净工作台，天津市泰斯特仪器有限公司，型号CJ-2S；倒置荧光显微镜，OLYMPUS公司，型号IX81；酶标仪，BIO-RAD公司，型号iMark 1509。
2 实验方法
2.1 大鼠骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测
采用全骨髓贴壁筛选法分离、纯化BMSCs，并进行纯度鉴定[3]，流式细胞仪检测F3代大鼠BMSCs表面CD45-CD90+。
2.2 经典化学药物诱导大鼠骨髓间充质干细胞的定向分化
取F3代细胞，采用随机数字表法分为神经细胞诱导组（A组）及其对照组（B组）、脂肪细胞诱导组（C组）及其对照组（D组）、成骨细胞诱导组（E组）及其对照组（F组）、软骨细胞诱导组（G组）及其对照组（H组），每组3瓶，独立重复3次。A组每瓶加入含1 mmol/L β-巯基乙醇的培养液，B组各加完全DMEM/F12培养液。在诱导3、5 h时在镜下观察细胞形态变化，于5 h时进行甲苯胺蓝染色，随机计数A、B组8个非重叠视野（20倍）内染色阳性的细胞数，并计算阳性率（染色阳性细胞数/100×100%）。C组每瓶加入成脂诱导液（含1 μmoL/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmoL/L IBMX、0.1 mmoL/L吲哚美辛、10%FBS的DMEM/F12培养液），E组每瓶加入成骨诱导液（含0.1 μmoL/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、0.5 mmol/L β-甘油磷酸钠、10%FBS的DMEM/F12培养液），G组每瓶加入软骨诱导液（含TGF-β2 10 ng/mL、0.1 μmoL/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸的不含血清的L-DMEM诱导液）；D、F、H组各加完全DMEM/F12培养液。C、D、E、F、G、H组分别在诱导3、7、14、21 d时镜下观察细胞形态变化，21 d时C、D组进行油红O染色，阳性细胞内脂滴被染成红色，随机计数各8个非重叠视野（20倍）内染色阳性的细胞数，计算阳性率；E、F组进行茜素红染色；G、H组进行甲苯胺蓝染色。
2.3 MTT法检测骨髓间充质干细胞增殖
F3代BMSCs接种于2个96孔板内，每个培养板分为空白组、对照组和5个黄芪多糖组（浓度分别为0.25、0.5、1、2、4 g/L），每组5个复孔。培养24 h，每组各加100 μL含不同浓度黄芪多糖培养液。在24、48 h时各取1个培养板，每孔加入10 μL的MTT溶液，避光孵育4 h后，每孔加入150 μL的DMSO低速振荡10 min。全自动酶标仪测490 nm处吸光值。独立重复3次。
2.4 黄芪多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化
2.4.1 甲苯胺蓝、油红O、茜素红染色观察 取F3代细胞，采用随机数字表法分为诱导组和对照组，每组3瓶。细胞达到80%融合后，对照组加入完全培养液3 mL，诱导组加入含1 g/L黄芪多糖的完全培养液3 mL，培养48 h，分别进行甲苯胺蓝、油红O、茜素红染色，随机计数8个非重叠视野（20倍），计算阳性率。
2.4.2 Western Blot法检测相关蛋白 取F3代细胞，采用随机数字表法分为诱导组和对照组，每组4瓶。诱导组加入含1 g/L黄芪多糖的完全培养液3 mL，对照组加入完全培养液3 mL，培养48 h，提取细胞总蛋白后检测NSE、LPL、胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ。加入RIPA缓冲液裂解细胞，测定蛋白质浓度。取50 μg蛋白量按比例与上样缓冲液混合，使终体积为20 μL，沸水浴煮沸5 min使蛋白充分变性。SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入1∶200倍稀释的兔抗NSE抗体、兔抗LPL抗体、兔抗胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅱ杂交2 h，TBST洗膜后加入1∶10 000倍稀释辣根酶标记山羊抗兔二抗，孵育1 h，TBST洗膜后进行ECL显色。