论文部分内容阅读
摘要：采集某焦化厂多环芳烃类污染土壤，实验室模拟土壤浸出液循环系统，研究了土壤中污染物浓度及其循环系统中微生物群落随时间的变化。结果表明经过35天修复，土壤中多环芳烃浓度从3347.46ppm降至915.87ppm。通过DGGE分析降解过程中微生物群落结构的变化，发现在降解过程中降解菌所占比重与降解速率两者具有一定的相关性，当降解进入停滞期时降解菌所占比重达到最大值，其后减少，保持在40%以上。
关键词：多环芳烃；梯度凝胶电泳；浸出液循环系统
中图分类号：Q938文献标识码： A
正文：多环芳烃化合物是由两个和两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的稠环化合物，可长久存在于环境中，具有强致癌、致畸与致突变等特性[1]。自然条件下，生物降解是多环芳烃自然衰减的最主要方式[2]。土壤浸出液中含有大量可溶性营养物质以及土著微生物。通过土壤浸出液循环技术进行污染土壤的修复，提高土壤中水分的流动速率，促进土壤中各种物质的扩散，使微生物群落快速稳定，以求提高污染物的降解速率。本研究模拟了特定温度下多环芳烃污染土壤浸出液循环系统，研究了其修复效果；利用变性梯度凝胶电泳技术揭示了修复过程中污染土壤里微生物群落结构变化；最后分析了根据多环芳烃的降解与微生物群落变化之间的关系。
材料和方法：
1.浸出液循环系统：
土壤样品采集自焦化厂重污染场地，长期4℃保存。土壤质地主要为粘质壤土，碳含量约3.5％。浸出液循环装置如图1所示，称取200g污染土壤放入漏斗中（漏斗下利用医用纱布进行过滤），加入200ml蒸馏水，蒸馏水通过土壤下渗进入三口烧瓶，三口烧瓶置于搅拌保温板上，恒温40℃，利用电磁搅拌器进行不定时搅拌。通过蠕动泵抽取三口烧瓶中浸出液，回灌至污染土壤中，流速为3ml/min。
图1 浸出液循环装置示意图
2.土壤总DNA提取
通过在Wen-Tso Liu等人的方法[3]上略作改动，进行土壤DNA的提取。土壤DNA粗提：称取0.5g土壤置于1.5ml离心管中，加入800μl裂解液（100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 0.75
M sucrose），反复震荡65℃水浴，重复3次，13000r/min离心5min，取上清加入等体积酚(酚/氯仿/异戊醇=25/24/1，v/v/v)，摇匀后14000r/min离心10min，取上清加入等体积氯仿/异戊醇（24/1，v/v），摇匀后14000r/min离心10min，-20℃下用异丙醇沉淀1h，14000r/min 离心10min，用70%乙醇清洗，离心，室温放置5min，加入200μlTE溶解。
DNA纯化：加入10μlRNase和20μl蛋白酶K(50mg/ml)，37℃水浴30min后酚氯仿异戊醇法抽提，乙醇沉淀后用70%乙醇清洗，溶于40 μlTE中。
3.16S rDNA V3区PCR
利用Bio-rad型PCR仪，将土壤中提纯得到的基因組DNA作为模板进行PCR扩增。采用16s rDNA V3引物357F-GC (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R (5’-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3’)[4]，扩增产物片段约190bp左右。
50μl反应体系组成为：2.5μl模板DNA，5μl PCR 10×buffer，1μldNTP，引物各1μl，0.7μlTaq酶，超纯水补至50μl。降落PCR反应程序，94℃下预变性10min，前20个循环为94℃下30s，65～55℃下1min，72℃下45s，（其中每个循环后退火温度下降0.5℃），后10个循环为95℃下1min，55℃下1min，72℃下45s，最后在72℃下延伸10min。扩增产物进行DGGE分析。
4.变性凝胶梯度电泳
采用的Bio-rad公司的DGGE系统对PCR产物进行电泳分离。制备聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为30%-60%，上样量50μl，60v电压下电泳20h，EB染色，利用Bio-rad公司的Quantity One（4.52）软件分析。
5. 微生物群落生物多样性分析
利用Bio-rad公司的QuantityOne软件分析DGGE图后计算生物多样性指数。包括三个多样性指数
Shannon-Weiner指数(多样性指数)：
Pielou指数（均匀度指数）：
Simpson指数（优势度指数）：
其中S为物种数目，Pi为种i个体在全部个体中的比例。
结果与讨论：
1.多环芳烃降解结果
经过浸出液循环系统的处理，多环芳烃浓度下降非常明显（见图2），14天即由3347.46ppm降至1242.03ppm，降解率达到62.9%，其后多环芳烃的浓度变化不大，降解35天后，多环芳烃浓度为888.89ppm，其中低分子量多环芳烃（LMW-PAHs）降解由2952.54ppm降至888.89ppm，高分子量多环芳烃（HMW-PAHs）由94.92ppm降至26.98ppm。这说明浸出液循环系统对多环芳烃的降解具有明显的效果。
图2土壤中多环芳烃残留浓度
DGGE及测序结果
对不同实验时期土壤DNA进行DGGE分析（结果见图3）。
图3不同时间土壤中微生物群落16s rDNA V3区DGGE图
微生物群落在组成和结构上表现出的多样性是研究微生物群落结构功能的基础。利用QuantityOne软件分析不同条带在的光密度，比较不同时间下微生物群落的多样性（见表2），各个时期的Simpson指数变化极小，数值都较大，这表明在降解的各个时期微生物的优势度都较大，优势种群对降解的影响十分关键。Shannon-Weiner和Pielou指数在第一天表现出较高水平后急剧下降，这显示水的选择作用造成了微生物群落多样性与均匀度的降低，这也许是由于部分不适应新环境的物种被淘汰，同期的优势度指数较高，说明被淘汰物种本身不占据优势地位。新群落中具有降解功能的微生物比例增加，这强化了群落的降解功能，从而有效的促进了降解的发生。
表1微生物多样性指数随时间变化
降解天数（天） 1 7 14 21 28 35
Shannon-Weiner’s Index 6.699 3.695 3.472 3.469 3.644 3.372
Simpson’s Index 0.888 0.899 0.892 0.862 0.883 0.878
Pielou’s Index 2.364 1.233 1.316 1.178 1.216 1.278
多环芳烃降解速率与微生物群落结构关系
利用QuantityOne软件进行多环芳烃降解菌所占比重分析，在降解快速进行阶段，多环芳烃降解菌所占比例上升，群落结构相对更加单一，通过一段时间的降解后，多环芳烃浓度有所降低，微生物可利用的多环芳烃减少，降解菌的生长受到抑制，这时其他微生物所占比例增加。这显示降解菌在全部微生物中所占比例应该能够反映出降解趋势的变化，我们希望能够在实际的修复工程中，通过检测土壤中微生物群落结构来实现对多环芳烃降解趋势的预测。
图4降解菌比例与多环芳烃含量随时间变化图
结束语：利用浸出液循环系统修复被多环芳烃污染的土壤是可行的，修复开始后，微生物群落结构发生变化，多环芳烃降解菌的比重增加，生物多样性减小，群落功能性增强，从而能够较快速的降解多环芳烃。土著降解菌在降解过程中大量增殖，降解速率越快，降解菌的比重相对越高，当降解进入停滞期时，降解菌的比重最大，达到67.19%。根据以上趋势研究，我们希望能够通过检测修复过程中微生物的群落变化来预测多环芳烃的降解趋势。
参考文献： [1] 骆苑蓉. 多环芳烃降解菌的降解特性与降解途径研究[D].厦门: 厦门大学, 2008, 7~9.
[2] Lee K, Tremblay GH, Gauthier J. Bioaugmentation and biostimμlation: Aparadox between laboratory and field resμlts[C]. International Oil Spill Conference, 1997: 697~705.
[3]Liu WT, Marsh TL, Cheng H, ForneyLJ. Characterization of Microbial Diversity by Determining Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms of Genes Encoding 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology,.1997, 63(11): 4516~4522.
关键词：多环芳烃；梯度凝胶电泳；浸出液循环系统
中图分类号：Q938文献标识码： A
正文：多环芳烃化合物是由两个和两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的稠环化合物，可长久存在于环境中，具有强致癌、致畸与致突变等特性[1]。自然条件下，生物降解是多环芳烃自然衰减的最主要方式[2]。土壤浸出液中含有大量可溶性营养物质以及土著微生物。通过土壤浸出液循环技术进行污染土壤的修复，提高土壤中水分的流动速率，促进土壤中各种物质的扩散，使微生物群落快速稳定，以求提高污染物的降解速率。本研究模拟了特定温度下多环芳烃污染土壤浸出液循环系统，研究了其修复效果；利用变性梯度凝胶电泳技术揭示了修复过程中污染土壤里微生物群落结构变化；最后分析了根据多环芳烃的降解与微生物群落变化之间的关系。
材料和方法：
1.浸出液循环系统：
土壤样品采集自焦化厂重污染场地，长期4℃保存。土壤质地主要为粘质壤土，碳含量约3.5％。浸出液循环装置如图1所示，称取200g污染土壤放入漏斗中（漏斗下利用医用纱布进行过滤），加入200ml蒸馏水，蒸馏水通过土壤下渗进入三口烧瓶，三口烧瓶置于搅拌保温板上，恒温40℃，利用电磁搅拌器进行不定时搅拌。通过蠕动泵抽取三口烧瓶中浸出液，回灌至污染土壤中，流速为3ml/min。
图1 浸出液循环装置示意图
2.土壤总DNA提取
通过在Wen-Tso Liu等人的方法[3]上略作改动，进行土壤DNA的提取。土壤DNA粗提：称取0.5g土壤置于1.5ml离心管中，加入800μl裂解液（100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 0.75
M sucrose），反复震荡65℃水浴，重复3次，13000r/min离心5min，取上清加入等体积酚(酚/氯仿/异戊醇=25/24/1，v/v/v)，摇匀后14000r/min离心10min，取上清加入等体积氯仿/异戊醇（24/1，v/v），摇匀后14000r/min离心10min，-20℃下用异丙醇沉淀1h，14000r/min 离心10min，用70%乙醇清洗，离心，室温放置5min，加入200μlTE溶解。
DNA纯化：加入10μlRNase和20μl蛋白酶K(50mg/ml)，37℃水浴30min后酚氯仿异戊醇法抽提，乙醇沉淀后用70%乙醇清洗，溶于40 μlTE中。
3.16S rDNA V3区PCR
利用Bio-rad型PCR仪，将土壤中提纯得到的基因組DNA作为模板进行PCR扩增。采用16s rDNA V3引物357F-GC (5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R (5’-GTATTACCGCGGCTGCTGG-3’)[4]，扩增产物片段约190bp左右。
50μl反应体系组成为：2.5μl模板DNA，5μl PCR 10×buffer，1μldNTP，引物各1μl，0.7μlTaq酶，超纯水补至50μl。降落PCR反应程序，94℃下预变性10min，前20个循环为94℃下30s，65～55℃下1min，72℃下45s，（其中每个循环后退火温度下降0.5℃），后10个循环为95℃下1min，55℃下1min，72℃下45s，最后在72℃下延伸10min。扩增产物进行DGGE分析。
4.变性凝胶梯度电泳
采用的Bio-rad公司的DGGE系统对PCR产物进行电泳分离。制备聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度梯度为30%-60%，上样量50μl，60v电压下电泳20h，EB染色，利用Bio-rad公司的Quantity One（4.52）软件分析。
5. 微生物群落生物多样性分析
利用Bio-rad公司的QuantityOne软件分析DGGE图后计算生物多样性指数。包括三个多样性指数
Shannon-Weiner指数(多样性指数)：
Pielou指数（均匀度指数）：
Simpson指数（优势度指数）：
其中S为物种数目，Pi为种i个体在全部个体中的比例。
结果与讨论：
1.多环芳烃降解结果
经过浸出液循环系统的处理，多环芳烃浓度下降非常明显（见图2），14天即由3347.46ppm降至1242.03ppm，降解率达到62.9%，其后多环芳烃的浓度变化不大，降解35天后，多环芳烃浓度为888.89ppm，其中低分子量多环芳烃（LMW-PAHs）降解由2952.54ppm降至888.89ppm，高分子量多环芳烃（HMW-PAHs）由94.92ppm降至26.98ppm。这说明浸出液循环系统对多环芳烃的降解具有明显的效果。
图2土壤中多环芳烃残留浓度
DGGE及测序结果
对不同实验时期土壤DNA进行DGGE分析（结果见图3）。
图3不同时间土壤中微生物群落16s rDNA V3区DGGE图
微生物群落在组成和结构上表现出的多样性是研究微生物群落结构功能的基础。利用QuantityOne软件分析不同条带在的光密度，比较不同时间下微生物群落的多样性（见表2），各个时期的Simpson指数变化极小，数值都较大，这表明在降解的各个时期微生物的优势度都较大，优势种群对降解的影响十分关键。Shannon-Weiner和Pielou指数在第一天表现出较高水平后急剧下降，这显示水的选择作用造成了微生物群落多样性与均匀度的降低，这也许是由于部分不适应新环境的物种被淘汰，同期的优势度指数较高，说明被淘汰物种本身不占据优势地位。新群落中具有降解功能的微生物比例增加，这强化了群落的降解功能，从而有效的促进了降解的发生。
表1微生物多样性指数随时间变化
降解天数（天） 1 7 14 21 28 35
Shannon-Weiner’s Index 6.699 3.695 3.472 3.469 3.644 3.372
Simpson’s Index 0.888 0.899 0.892 0.862 0.883 0.878
Pielou’s Index 2.364 1.233 1.316 1.178 1.216 1.278
多环芳烃降解速率与微生物群落结构关系
利用QuantityOne软件进行多环芳烃降解菌所占比重分析，在降解快速进行阶段，多环芳烃降解菌所占比例上升，群落结构相对更加单一，通过一段时间的降解后，多环芳烃浓度有所降低，微生物可利用的多环芳烃减少，降解菌的生长受到抑制，这时其他微生物所占比例增加。这显示降解菌在全部微生物中所占比例应该能够反映出降解趋势的变化，我们希望能够在实际的修复工程中，通过检测土壤中微生物群落结构来实现对多环芳烃降解趋势的预测。
图4降解菌比例与多环芳烃含量随时间变化图
结束语：利用浸出液循环系统修复被多环芳烃污染的土壤是可行的，修复开始后，微生物群落结构发生变化，多环芳烃降解菌的比重增加，生物多样性减小，群落功能性增强，从而能够较快速的降解多环芳烃。土著降解菌在降解过程中大量增殖，降解速率越快，降解菌的比重相对越高，当降解进入停滞期时，降解菌的比重最大，达到67.19%。根据以上趋势研究，我们希望能够通过检测修复过程中微生物的群落变化来预测多环芳烃的降解趋势。
参考文献： [1] 骆苑蓉. 多环芳烃降解菌的降解特性与降解途径研究[D].厦门: 厦门大学, 2008, 7~9.
[2] Lee K, Tremblay GH, Gauthier J. Bioaugmentation and biostimμlation: Aparadox between laboratory and field resμlts[C]. International Oil Spill Conference, 1997: 697~705.
[3]Liu WT, Marsh TL, Cheng H, ForneyLJ. Characterization of Microbial Diversity by Determining Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisms of Genes Encoding 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology,.1997, 63(11): 4516~4522.