【摘 要】
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【目的】建立抗犬细小病毒（CPV）纳米抗体（Nb）库，从中筛选出具有中和活性的Nb。【方法】以高免比格犬脾脏组织cDNA进行重链可变区（VH）扩增，与pBSD载体连接，构建pBSD-Nb库。结合细菌展示、流式细胞仪检测，在pBSD-Nb库中筛选高亲和力的Nb,获得阳性克隆并测序。利用Primer Premier 5.0软件设计Nb基因的上、下游引物，将阳性克隆质粒中Nb基因片段进行PCR扩增。利用
【机 构】
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东北农业大学生命科学学院生物制药实验室
【基金项目】
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国家自然科学基金（32172892、32100754）；
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【目的】建立抗犬细小病毒（CPV）纳米抗体（Nb）库，从中筛选出具有中和活性的Nb。【方法】以高免比格犬脾脏组织cDNA进行重链可变区（VH）扩增，与pBSD载体连接，构建pBSD-Nb库。结合细菌展示、流式细胞仪检测，在pBSD-Nb库中筛选高亲和力的Nb,获得阳性克隆并测序。利用Primer Premier 5.0软件设计Nb基因的上、下游引物，将阳性克隆质粒中Nb基因片段进行PCR扩增。利用pET-27b表达目的蛋白，通过变性、复性手段纯化目的蛋白，用SDS-PAGE分析纯化后的蛋白。将Nb包被96孔板，采用ELISA法检测Nb对CPV的亲和力。通过病毒微量中和试验检测Nb抑制CPV感染猫肾细胞（F81）的情况。【结果】PCR扩增结果显示，在384 bp处可见明显条带，与预期大小相符，证明pBSD-Nb库构建成功。细菌展示后，流式细胞术检测结果显示，有9株阳性峰偏移率高的Nb,分别命名为Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9。PCR扩增9株Nb基因片段，获得384 bp的条带。SDS-PAGE结果显示，在约14 ku处有一条带，说明成功获得纯化蛋白。ELISA检测结果表明，9株Nb中有6株Nb对CPV的亲和力较强。体外病毒中和试验检测发现，1株Nb能够中和病毒，抑制F81细胞病变，中和病毒的有效浓度为0.05 mg/mL。【结论】本研究成功建立pBSD-Nb库，筛选出6株对CPV具有高亲和力的Nb,并成功获得1株具有中和活性的Nb,为CPV治疗性抗体制剂的开发提供了新的思路。
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