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摘要：采用硅胶柱色谱及薄层制备色谱等手段从真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）壳中分离纯化出了3种化合物。对所获得的化合物经过理化性质、波谱分析和文献对照的方法进行了结构鉴定。同时，采用CCK-8方法对75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏进行了抑制人肝癌细胞HepG2生长测试。结果表明，从真海鞘壳中分离得到3种化合物分别为：Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）、胆甾醇（化合物2）和6-（2，，3，-Dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。体外测试表明，75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏具有显著抑制人肝癌细胞HepG2生长的活性，可作为潜在的抗肿瘤药物进行进一步研究。
关键词：真海鞘；化学成分；结构鉴定；人肝癌细胞HepG2
真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）主要分布于日本的海男鹿半岛以北的海域及韩国的东海岸和南海岸[1]。真海鞘可食部分含有丰富的营养成分，味道鲜美，深受人们的欢迎。李春艳等研究了真海鞘的营养价值，发现其可食部分除了含有丰富的氨基酸及矿物质以外，还含有丰富的必需不饱和脂肪酸[2]。近年来，辽宁和山东进行了真海鞘的引进和养殖，目前已经形成一定的规模化养殖[3]。真海鞘体外是呈橙红色具有很多乳头状突起的被囊（壳），是不可食部分，目前大多被当成废物废弃[1]。
海洋生物生活环境与陆生生物的生活环境不同。海洋生物生活环境往往更加极端，如高盐、高压环境，它们为了适应这样的生活环境，往往产生一些特殊结构的代谢中间产物。海洋生物所含有的特殊结构的代谢中间产物往往又成为潜在的药源生物活性物质。对真海鞘壳化学成分的研究未见报道。本研究中，对真海鞘壳化学成分分离及其浸膏抗肿瘤活性进行了研究，旨在为真海鞘壳的开发利用提供基础数据。
1材料和方法
1.1材料
真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）2013年10月于山东省威海市荣成寻山集团采购；人肝癌细胞HepG2来自中国科学院上海细胞库；D101大孔吸附树脂柱购于天津市海光化工有限公司；硅胶（20～300mesh，10～40 μm）及薄层层析硅胶（Silica gel for Thin-layer Chromatography，HG/ T2354-92）购于青岛海洋化工有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶购于Sigma公司；CCK-8检测试剂盒（Dojindo，CK04）来自株式会社同仁化学研究所；其他试剂为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1真海鞘壳浸膏的制备真海鞘壳（湿重21 kg）洗去泥沙，剪成约2 cm×2 cm的小块，置于圆底烧瓶中，加入3倍量的75% EtOH，加热回流提取2 h，提取3次，制成浸膏并称重，放入冰箱中冷冻保藏备用。
依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取到的浸膏进行3次萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取部分（9 g）、乙酸乙酯萃取部分（13 g）和正丁醇萃取部分（16 g）。
1.2.2真海鞘壳化学成分的分离将石油醚萃取部分9 g溶于适量的石油醚中，在石油醚溶液中加入15 g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用100 g 300～400目硅胶进行湿法装柱（2.5×70 cm），先用石油醚平衡，将混有石油醚萃取部分硅胶加入到柱的上层，用石油醚：乙酸乙酯（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600 mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到8个组分，记为a、b、c、d、e、f、g和h组分（根据极性从小到大标记），a组分为化合物1（41 mg），对b组分进行重结晶，得化合物2 （120 mg）。
将正丁醇萃取部分16 g溶于适量的乙酸乙酯中，并向其中加入24 g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用160 g 300～400目硅胶进行湿法装柱（3×100 cm），先用乙酸乙酯平衡，将混有正丁醇萃取部分硅胶加入到柱的上层，用乙酸乙酯：甲醇（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600 mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到9个组分，记为a、b、c、d、e、f、g、h和j组分（根据极性从小到大标记），对c组分进行制备薄层色谱层析，对刮板洗脱浓缩得到的组分进行重结晶，得化合物3（10.5 mg）。
1.2.3结构鉴定核磁共振光谱（NMR）在Bruker Avance DRX 500核磁共振仪（500/125 MHz）上进行，以四甲基硅烷（TMS）作内标。
1.2.4真海鞘壳浸膏总甾体含量的测定按照田丽冉等的方法利用香草醛-硫酸溶液真海鞘壳浸膏进行总甾体含量的测定[4]。
1.2.5体外抗肿瘤活性测定称取真海鞘壳浸膏 40 mg ，用20 mL乙醇溶解配制成浓度为2 mg/mL的药液备用。
将HepG2细胞悬液接种于96孔培养板中（3×103个细胞/孔），于37 ℃ 5%CO2 培养箱培养，加药之前在显微镜下对细胞进行观察。将药液加入96孔培养板中，终浓度分别为2 μg/mL、20 μg/mL及200 μg/mL，共同孵育2 h、6 h、12 h、36 h，然后在显微镜下对细胞进行观察。同时，每孔加入10 μL CCK-8，混匀后培养箱中孵育3 h，测定450 nm处的吸光值。 1.2.6数据处理实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析。
2结果与分析
2.1真海鞘壳浸膏的制备及化学成分的分离
利用75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏亲水性较大，其含水量为5.12%，其总甾体含量为14.13%。对真海鞘壳浸膏石油醚萃取部分进一步分离，得化合物1和化合物2。
化合物1为白色似油状物。13C NMR （126 MHz，CDCl3） δ107.31（s），114.11（s），139.26（s），39.44 （s），37.44 （s），37.17 （s），34.73 （s），33.89 （dd，J= 67.3，50.3 Hz），33.27 （s），32.82 （s），3200 （s），30.11 （m），29.78 （d，J= 5.1 Hz），29.74 （d，J= 5.1 Hz），29.44 （s），29.03 （m），27.16 （s），26.77 （s），24.54 （s），23.24 （s），22.73（m），19.77（m），14.20 （d，J= 7.8 Hz），11.46 （s），1092 （s），7.56 （s），1.06 （s）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物1为Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate，分子式为C56H112O40（图1）[5]。
图1化合物1
化合物2为白色针状固体，易溶于丙酮，可溶于甲醇及乙醇。醋酸酐-浓硫酸反应呈阳性，表明为甾体类化合物。13C NMR数据及维普数据库查询，与胆甾醇标准品一致，可以确定化合物2为胆甾醇 （Cholesterol），分子式为C27H46O。
对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物3。化合物3为白色固体粉末，易溶于甲醇。1H NMR （600 MHz，DMSO-d6）数据如下： δ8.13 （s，1H），8.35 （s，1H），7.35 （s，1H），7.35 （s，1H），5.87 （d，1H，6.2 Hz），4.61 （dd，1H，6.0，11.4 Hz），4.14 （q，1H，3.3 Hz），3.96 （dd，1H，3.3，6.6 Hz），3.65 （dt，1H，12.0，4.0 Hz），3.56 （m，1H），5.45 （d，1H，7.0 Hz），5.18 （d，1H，5.2 Hz），5.44 （m，1H）。13C NMR （150 Mz，DMSO-d6） 数据如下： δ156.3，1563，149.2，152.5（C-3，C-4，C-6，C-7），119.5，140.6（V-1，C-5，C-6，C-8），149.2，88.09（C-2’，C-3’，C-4，C-7，C-8），73.8 （C-1’），71.0（C-1’，C-4’），86.0，62.1（C-1’，C-3’）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物3为生物碱6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol，分子式为C12H13NO6（图2）[6]。
图2化合物32.2抑制人肝癌细胞HepG2生长活性测定
不同浓度的真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养，不同培养时间后进行CCK-8检测，结果如图3。由图3可以看出，HepG2细胞在无药物添加的时候，随着培养时间延长，HepG2细胞以一定的速率增殖。当真海鞘壳总浸膏浓度为2 μg/mL时，随着培养时间延长到36 h时，培养液吸光度值下降，表明HepG2细胞增殖受到一定抑制。随着真海鞘壳总浸膏浓度增加，HepG2细胞增殖抑制效果逐渐增加。当真海鞘壳总浸膏浓度增大到为200 μg/mL时，HepG2细胞增殖受到明显抑制。
图3HepG2细胞与不同浓度真海鞘壳
总浸膏共同培养的CCK-8检测结果
真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后，对HepG2细胞进行形态学观察。对照组细胞边界清楚，折光度好，胞质饱满（图4A）。真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞有破损现象，细质内充满圆形、透明的颗粒，显示有较多脂滴（图4B）[7-8]。
A 对照组细胞；B 真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞
图4显微镜下HepG2细胞形态（20×）
3讨论
对真海鞘壳75%（体积分数）的乙醇浸膏中石油醚萃取部分进一步分离，得到2个化合物，分别为Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）和胆甾醇（化合物2）。对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。化合物1首次发现于从中国南海西沙群岛永胜岛附近海域里生长的海绵中[5]。化合物3首次发现于板栗中[6]。在真海鞘壳中发现化合物1与化合物3是首次报道。
CCK-8法是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法，具有操作简单、灵敏度高、准确性和重复性好的特点[9]。在本研究中，使用CCK-8法对真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞进行计数。结果发现，真海鞘壳总浸膏对HepG2细胞具有显著抑制作用，且有剂量依赖性。真海鞘壳总浸膏中含有多种化学成分，其中比较多的化学成分有总甾体化合物，达到14.13%，这提示我们进一步研究，可以获得潜在的具有抑制HepG2细胞的化学成分。 对真海鞘中活性物质的研究报道不多。Shirakata等从真海鞘体壁中分离出29 kDa蛋白质]。Harada-Azumi等从真海鞘血淋巴中分离出一种分子量为28 kDa的Ca2+依赖型的N-乙酰-半乳糖酰胺（N-acetyl-galactosamine）特异性的凝集素[11]。日本与韩国的研究者在真海鞘内发现了甘氨酸甜菜碱、龙虾肌碱、葫芦巴碱、氧化三甲胺、三甲胺等化学成分[2]。在真海鞘中不断发现的新化学成分，丰富了真海鞘活性物质的数据，为利用真海鞘提供了更多的可能性。
参考文献：
[1] 李文姬.韩国的真海鞘养殖[J].水产科学，2004，23（7）：27-30
[2] 李春艳，李丹彤，银学祥，等.真海鞘营养成分的分析与评价[J].大连水产学院学报，2007，22（5）：347-351
[3] 王大建，赵城南，汤天堂，等.真海鞘人工育苗与海上养成技术[J].齐鲁药业，2007，24（9）：17-18
[4] 田丽冉，朱春芃，曲敏，等.海星中抑制ACE活性的甾体化合物的分离纯化[J].大连海洋大学学报，2014，29（4）：409-412
[5] 傅建龙，龙康候.中国南海海绵化学成份研究II-F[J].华南理工大学学报（自然科学版），1991，19（3）：112-116
[6] Zhang DS，Gao HY，Tang ZS，et al.A new alkaloid from Castanea mollisima Blume[J].Chinese Chemical Letters，2008，19：832-834
[7] 何松，沈薇，沈鼎明.体外观察紫衫醇对肝癌HepG2细胞生长的影响[J].重庆医学，2003（3）：268-230
[8] 司维柯，肖桃元，康格非.苦参碱对人肝癌细胞HepG2的细胞形态影响和相关增殖因素的变化[J].第二军医大学学报，2000，22（6）：553-556
[9] 李宁，万文婷，金林洪.CKK-8法和MTT法检测人前列腺癌PC3细胞活性的最佳条件比较研究[J].贵州大学学报（自然科学版），2009，26（3）：18-24
[10] Shirakata M，Takagi T，Konishi K.Isolation and characterization of a 29，000 Dalton protein from ascidian （Halocynthia roretzi） body wall muscle[J].Comparative Biochemistry and Physiology，1986，85B（1）：71–76
[11] Harada-Azumi K，Yokosawa H，Ishii S.-I.N-acetyl-galactosamine-specific lectin，a novel lectin in the haemolymph of the ascidian Halocynthia roretzi： isolation，characterization and comparison with galactose-specific lectin[J].Comparative Biochemistry and Physiology，1987，88B（1）：375–381
Isolation of constituents in Halocynthia roretzi Drasche sell and
inhibitory activity of extracts from H.roretzi against HepG2 cells
ZHAI Xingyue1，HOU Xiuxiu2，TONG Changqing2，DU Ying3，LI Wei2
（1.Nutrition Department，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China；
2.College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；
3.Dalian Center for Disease Control and Prevention，Dalian 116021，China）
Abstract：Three compounds were isolated from Halocynthia roretzi Drasche shell by column chromatography on silica gel and thin layer chromatography.Their structures were identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry properties.The inhibition on HepG2 cells of all extracts from H.roretzi sell were evaluated by CCK-8 assay.The results showed that three compounds were obtained and identified as Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate （compound 1），cholesterol （compound 2） and 6-（2’，3’-dihydroxy-4’-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1’-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol （compound 3）.All extracts from H.roretzi sell using 75% EtOH exhibited the potent inhibitory activities against HepG2 cells.The extracts could be considered as potential anticancer candidate for further study.
Key words：Halocynthia roretzi Drasche；constituent；structural identification；HepG2 cells
关键词：真海鞘；化学成分；结构鉴定；人肝癌细胞HepG2
真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）主要分布于日本的海男鹿半岛以北的海域及韩国的东海岸和南海岸[1]。真海鞘可食部分含有丰富的营养成分，味道鲜美，深受人们的欢迎。李春艳等研究了真海鞘的营养价值，发现其可食部分除了含有丰富的氨基酸及矿物质以外，还含有丰富的必需不饱和脂肪酸[2]。近年来，辽宁和山东进行了真海鞘的引进和养殖，目前已经形成一定的规模化养殖[3]。真海鞘体外是呈橙红色具有很多乳头状突起的被囊（壳），是不可食部分，目前大多被当成废物废弃[1]。
海洋生物生活环境与陆生生物的生活环境不同。海洋生物生活环境往往更加极端，如高盐、高压环境，它们为了适应这样的生活环境，往往产生一些特殊结构的代谢中间产物。海洋生物所含有的特殊结构的代谢中间产物往往又成为潜在的药源生物活性物质。对真海鞘壳化学成分的研究未见报道。本研究中，对真海鞘壳化学成分分离及其浸膏抗肿瘤活性进行了研究，旨在为真海鞘壳的开发利用提供基础数据。
1材料和方法
1.1材料
真海鞘（Halocynthia roretzi Drasche）2013年10月于山东省威海市荣成寻山集团采购；人肝癌细胞HepG2来自中国科学院上海细胞库；D101大孔吸附树脂柱购于天津市海光化工有限公司；硅胶（20～300mesh，10～40 μm）及薄层层析硅胶（Silica gel for Thin-layer Chromatography，HG/ T2354-92）购于青岛海洋化工有限公司；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶购于Sigma公司；CCK-8检测试剂盒（Dojindo，CK04）来自株式会社同仁化学研究所；其他试剂为国产分析纯。
1.2方法
1.2.1真海鞘壳浸膏的制备真海鞘壳（湿重21 kg）洗去泥沙，剪成约2 cm×2 cm的小块，置于圆底烧瓶中，加入3倍量的75% EtOH，加热回流提取2 h，提取3次，制成浸膏并称重，放入冰箱中冷冻保藏备用。
依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇对提取到的浸膏进行3次萃取，浓缩，分别得到石油醚萃取部分（9 g）、乙酸乙酯萃取部分（13 g）和正丁醇萃取部分（16 g）。
1.2.2真海鞘壳化学成分的分离将石油醚萃取部分9 g溶于适量的石油醚中，在石油醚溶液中加入15 g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用100 g 300～400目硅胶进行湿法装柱（2.5×70 cm），先用石油醚平衡，将混有石油醚萃取部分硅胶加入到柱的上层，用石油醚：乙酸乙酯（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600 mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到8个组分，记为a、b、c、d、e、f、g和h组分（根据极性从小到大标记），a组分为化合物1（41 mg），对b组分进行重结晶，得化合物2 （120 mg）。
将正丁醇萃取部分16 g溶于适量的乙酸乙酯中，并向其中加入24 g的300～400目硅胶并搅拌均匀，挥发溶剂使样品充分吸附。用160 g 300～400目硅胶进行湿法装柱（3×100 cm），先用乙酸乙酯平衡，将混有正丁醇萃取部分硅胶加入到柱的上层，用乙酸乙酯：甲醇（100∶1-100∶100）的洗脱液进行梯度洗脱，每个比例进行5个柱体积的洗脱，分别收集洗脱液（每组分约600 mL）。通过薄层层析法跟踪检测每个组分，并通过显色结果合并浓缩各组分，共得到9个组分，记为a、b、c、d、e、f、g、h和j组分（根据极性从小到大标记），对c组分进行制备薄层色谱层析，对刮板洗脱浓缩得到的组分进行重结晶，得化合物3（10.5 mg）。
1.2.3结构鉴定核磁共振光谱（NMR）在Bruker Avance DRX 500核磁共振仪（500/125 MHz）上进行，以四甲基硅烷（TMS）作内标。
1.2.4真海鞘壳浸膏总甾体含量的测定按照田丽冉等的方法利用香草醛-硫酸溶液真海鞘壳浸膏进行总甾体含量的测定[4]。
1.2.5体外抗肿瘤活性测定称取真海鞘壳浸膏 40 mg ，用20 mL乙醇溶解配制成浓度为2 mg/mL的药液备用。
将HepG2细胞悬液接种于96孔培养板中（3×103个细胞/孔），于37 ℃ 5%CO2 培养箱培养，加药之前在显微镜下对细胞进行观察。将药液加入96孔培养板中，终浓度分别为2 μg/mL、20 μg/mL及200 μg/mL，共同孵育2 h、6 h、12 h、36 h，然后在显微镜下对细胞进行观察。同时，每孔加入10 μL CCK-8，混匀后培养箱中孵育3 h，测定450 nm处的吸光值。 1.2.6数据处理实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件作单因素方差分析。
2结果与分析
2.1真海鞘壳浸膏的制备及化学成分的分离
利用75%EtOH浸提所获得的真海鞘壳浸膏亲水性较大，其含水量为5.12%，其总甾体含量为14.13%。对真海鞘壳浸膏石油醚萃取部分进一步分离，得化合物1和化合物2。
化合物1为白色似油状物。13C NMR （126 MHz，CDCl3） δ107.31（s），114.11（s），139.26（s），39.44 （s），37.44 （s），37.17 （s），34.73 （s），33.89 （dd，J= 67.3，50.3 Hz），33.27 （s），32.82 （s），3200 （s），30.11 （m），29.78 （d，J= 5.1 Hz），29.74 （d，J= 5.1 Hz），29.44 （s），29.03 （m），27.16 （s），26.77 （s），24.54 （s），23.24 （s），22.73（m），19.77（m），14.20 （d，J= 7.8 Hz），11.46 （s），1092 （s），7.56 （s），1.06 （s）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物1为Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate，分子式为C56H112O40（图1）[5]。
图1化合物1
化合物2为白色针状固体，易溶于丙酮，可溶于甲醇及乙醇。醋酸酐-浓硫酸反应呈阳性，表明为甾体类化合物。13C NMR数据及维普数据库查询，与胆甾醇标准品一致，可以确定化合物2为胆甾醇 （Cholesterol），分子式为C27H46O。
对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物3。化合物3为白色固体粉末，易溶于甲醇。1H NMR （600 MHz，DMSO-d6）数据如下： δ8.13 （s，1H），8.35 （s，1H），7.35 （s，1H），7.35 （s，1H），5.87 （d，1H，6.2 Hz），4.61 （dd，1H，6.0，11.4 Hz），4.14 （q，1H，3.3 Hz），3.96 （dd，1H，3.3，6.6 Hz），3.65 （dt，1H，12.0，4.0 Hz），3.56 （m，1H），5.45 （d，1H，7.0 Hz），5.18 （d，1H，5.2 Hz），5.44 （m，1H）。13C NMR （150 Mz，DMSO-d6） 数据如下： δ156.3，1563，149.2，152.5（C-3，C-4，C-6，C-7），119.5，140.6（V-1，C-5，C-6，C-8），149.2，88.09（C-2’，C-3’，C-4，C-7，C-8），73.8 （C-1’），71.0（C-1’，C-4’），86.0，62.1（C-1’，C-3’）。以上波谱数据并结合维普数据库查询，确定化合物3为生物碱6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol，分子式为C12H13NO6（图2）[6]。
图2化合物32.2抑制人肝癌细胞HepG2生长活性测定
不同浓度的真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养，不同培养时间后进行CCK-8检测，结果如图3。由图3可以看出，HepG2细胞在无药物添加的时候，随着培养时间延长，HepG2细胞以一定的速率增殖。当真海鞘壳总浸膏浓度为2 μg/mL时，随着培养时间延长到36 h时，培养液吸光度值下降，表明HepG2细胞增殖受到一定抑制。随着真海鞘壳总浸膏浓度增加，HepG2细胞增殖抑制效果逐渐增加。当真海鞘壳总浸膏浓度增大到为200 μg/mL时，HepG2细胞增殖受到明显抑制。
图3HepG2细胞与不同浓度真海鞘壳
总浸膏共同培养的CCK-8检测结果
真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后，对HepG2细胞进行形态学观察。对照组细胞边界清楚，折光度好，胞质饱满（图4A）。真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞有破损现象，细质内充满圆形、透明的颗粒，显示有较多脂滴（图4B）[7-8]。
A 对照组细胞；B 真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞
图4显微镜下HepG2细胞形态（20×）
3讨论
对真海鞘壳75%（体积分数）的乙醇浸膏中石油醚萃取部分进一步分离，得到2个化合物，分别为Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate（化合物1）和胆甾醇（化合物2）。对真海鞘壳浸膏正丁醇萃取部分进一步分离，得化合物6-（2，，3，-dihydroxy-4，-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1，-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol（化合物3）。化合物1首次发现于从中国南海西沙群岛永胜岛附近海域里生长的海绵中[5]。化合物3首次发现于板栗中[6]。在真海鞘壳中发现化合物1与化合物3是首次报道。
CCK-8法是一种优于MTT法的检测细胞增殖活性的方法，具有操作简单、灵敏度高、准确性和重复性好的特点[9]。在本研究中，使用CCK-8法对真海鞘壳总浸膏与HepG2细胞共同培养后的细胞进行计数。结果发现，真海鞘壳总浸膏对HepG2细胞具有显著抑制作用，且有剂量依赖性。真海鞘壳总浸膏中含有多种化学成分，其中比较多的化学成分有总甾体化合物，达到14.13%，这提示我们进一步研究，可以获得潜在的具有抑制HepG2细胞的化学成分。 对真海鞘中活性物质的研究报道不多。Shirakata等从真海鞘体壁中分离出29 kDa蛋白质]。Harada-Azumi等从真海鞘血淋巴中分离出一种分子量为28 kDa的Ca2+依赖型的N-乙酰-半乳糖酰胺（N-acetyl-galactosamine）特异性的凝集素[11]。日本与韩国的研究者在真海鞘内发现了甘氨酸甜菜碱、龙虾肌碱、葫芦巴碱、氧化三甲胺、三甲胺等化学成分[2]。在真海鞘中不断发现的新化学成分，丰富了真海鞘活性物质的数据，为利用真海鞘提供了更多的可能性。
参考文献：
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Isolation of constituents in Halocynthia roretzi Drasche sell and
inhibitory activity of extracts from H.roretzi against HepG2 cells
ZHAI Xingyue1，HOU Xiuxiu2，TONG Changqing2，DU Ying3，LI Wei2
（1.Nutrition Department，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116023，China；
2.College of Food Science and Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；
3.Dalian Center for Disease Control and Prevention，Dalian 116021，China）
Abstract：Three compounds were isolated from Halocynthia roretzi Drasche shell by column chromatography on silica gel and thin layer chromatography.Their structures were identified by spectroscopic analysis and physical-chemistry properties.The inhibition on HepG2 cells of all extracts from H.roretzi sell were evaluated by CCK-8 assay.The results showed that three compounds were obtained and identified as Diethyl 24-[（Z）-3-methy-1-hexenyl]-heptatetracontanedioate （compound 1），cholesterol （compound 2） and 6-（2’，3’-dihydroxy-4’-hydroxymethyl-tetrahydro-furan-1’-yl）cyclopentadiene[c]pyrrole-1，3-diol （compound 3）.All extracts from H.roretzi sell using 75% EtOH exhibited the potent inhibitory activities against HepG2 cells.The extracts could be considered as potential anticancer candidate for further study.
Key words：Halocynthia roretzi Drasche；constituent；structural identification；HepG2 cells