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摘要：目的 建立利舒康胶囊中盐酸小檗碱及黄柏碱的含量测定方法。方法 色谱柱为Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）梯度洗脱，流速为 1 mL/min，检测波长为284 nm。结果 盐酸小檗碱在403.4～10 084.7 μg范围内呈良好线性关系（r2=0.9991），平均回收率为99.8%，RSD=1.7%；黄柏碱在169.137 6～4228.44 μg范围内呈良好的线性关系（r2=0.9992），平均回收率为95.5%，RSD=3.2%。结论 该方法准确、灵敏、重复性好，可用于利舒康胶囊中黄柏的质量控制。
关键词：利舒康胶囊；含量测定；盐酸小檗碱；黄柏碱
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0072-03
利舒康胶囊是由手参、甘青青兰、红景天、烈香杜鹃等6味药组成的中药复方制剂，具有健脾补胃、生精养血、益肺宁心的功效。原标准收载于《国家中成药标准汇编》内科气血津液分册[1]，其执行标准号为WS-10677（ZD-0677）-2002，检验项目为甘草、黄柏的薄层色谱鉴别和盐酸小檗碱的薄层扫描含量测定，而盐酸小檗碱在黄连、黄柏、三颗针药材中均存在，以其作为含量测定指标不具有专属性。为进一步控制产品的内在质量，本试验采用高效液相色谱法（HPLC），以紫外检测器（UV）作为检测手段，对制剂中盐酸小檗碱及黄柏碱进行了含量测定研究，从而更加全面有效地控制利舒康胶囊中黄柏的质量。
1 仪器与试药
Agilent高效液相色谱仪（四元泵，DAD检测器，自动进样器），CP225D电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。
利舒康胶囊样品由青海益欣药业有限责任公司提供；乙腈（色谱纯，Burdic&Jackson），水为Milli-Q超纯水，其余试剂为分析纯。对照品盐酸小檗碱（110713-200609）、黄柏碱（11895-201001）均购自中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱；以0.1%磷酸（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱（0～25 min，32%B；25～26 min，50%B；26～35 min， 50%B）。流速：1 mL/min；检测波长：284 nm；进样量：10 ?L；理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱（10.28 mg）、黄柏碱对照品（10.02 mg），加甲醇制成每1 mL含盐酸小檗碱40 ?g、黄柏碱10 ?g的混合溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液 取本品0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min（500 W，40 kHz），放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续液，即得。
2.2.3 阴性对照溶液 取缺黄柏利舒康胶囊试样（自制），按“2.2.2”项下方法制备，得阴性对照溶液。
2.3 专属性试验
精密吸取“2.2”项下的3种溶液各10 ?L，注入液相色谱仪依法测定，在供试品色谱峰与对照品色谱峰相应保留时间的位置上，供试品有相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液无干扰。见图1。
2.4 线性关系考察
精密称取盐酸小檗碱对照品10.28 mg（含量98.1%），置50 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，配置系列浓度为0.040 34、0.121 02、0.201 69、0.403 39、0.605 01、1.008 47 ?g/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，盐酸小檗碱回归方程为：Y=25837.0561X+20.330 8，r2=0.999 1，结果表明盐酸小檗碱在403.4～10 084.7 ?g范围内呈良好的线性关系。
精密称取黄柏碱对照品10.02 mg（含量84.4%），置100 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，配置系列浓度为0.169 137 6、0.338 275 2、0.507 412 8、0.845 688、2.537 064、4.228 44 ?g/mL的盐酸小檗碱对照品溶液测定峰面积，按色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，黄柏碱回归方程为：Y=13 156.676 3X+13.558 7，r2=0.9992，结果表明黄柏碱169.137 6～4228.44 ?g范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取“2.2.1”项下对照品溶液10 ?L，连续进样5次，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果盐酸小檗碱、黄柏碱的RSD分别为0.6%、1.9%，表明精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批样品6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果盐酸小檗碱及黄柏碱含量的平均值（n=6）分别为每粒1.27、0.36 mg，RSD分别为1.3%、1.8%，结果表明本方法重复性较好。
2.7 稳定性试验
取同一样品的供试品溶液，置室温下放置，分别在0、2、4、6、8、12、16、24 h各进样10 ?L，测定盐酸小檗碱、黄柏碱RSD分别为1.5%、1.1%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。 2.8 加样回收率试验
精密称取已测盐酸小檗碱、黄柏碱含量的样品6份，每份各约0.25 g，分别加入盐酸小檗碱对照品、黄柏碱对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备，并测定含量。结果盐酸小檗碱、黄柏碱的平均回收率（n=6）分别为99.9%（RSD=1.7%）、95.5%（RSD=3.2%）。结果见表1。
2.9 样品含量测定
取10批样品，按含量测定方法测定，结果见表2。
3 讨论
本试验用二极管振列检测器在200～400 nm进行光谱扫描，盐酸小檗碱最大吸收波长为345 nm，黄柏碱最大吸收波长为284 nm，在345 nm下黄柏碱几乎没有吸收，因此选择284 nm作为检测波长对盐酸小檗碱和黄柏碱同时测定[1-2]。
以文献[3-5]报道的乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%三乙胺（磷酸调pH 2.5）、乙腈-0.1%磷酸（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）作为流动相，结果采用后者进行梯度洗脱使样品中盐酸小檗碱和黄柏碱在同一色谱条件下较好地得到分离。本试验增加了对利舒康胶囊中盐酸小檗碱及黄柏碱含量的测定，可以更全面地控制产品的质量，保证临床用药的安全有效。
供试品溶液制备中，分别采用甲醇、乙醇、50%乙醇及50%甲醇作为溶剂，对盐酸小檗碱及黄柏碱的含量测定结果没有显著差异，但以乙醇、50%乙醇及50%甲醇作为溶剂时色谱峰较多，故选用甲醇作为提取溶剂。分别采用超声、回流2种提取方式，并设定不同的提取时间，对盐酸小檗碱及黄柏碱的含量进行测定，结果表明超声30 min为最佳提取方式。
参考文献：
[1] 国家食品药品监督管理局.国家中成药标准汇编：内科气血津液分册[S].2002：65.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：346.
[3] 潘超，张莉，王玉. HPLC法同时测定二妙丸中黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马丁和盐酸小檗碱的含量[J].中国生化药物杂志，2012， 33（4）：361-364.
[4] 陈天朝，翟来超.HPLC梯度洗脱测定黄柏中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J].中医研究，2011，24（4）：23-25.
[5] 祝晨蔯，林朝展，莫建霞，等.HPLC法测定黄柏药材中小檗碱与黄柏碱的含量[J].中药新药与临床药理，2004，15（4）：262-264.
（收稿日期：2013-06-15，编辑：陈静）
关键词：利舒康胶囊；含量测定；盐酸小檗碱；黄柏碱
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0072-03
利舒康胶囊是由手参、甘青青兰、红景天、烈香杜鹃等6味药组成的中药复方制剂，具有健脾补胃、生精养血、益肺宁心的功效。原标准收载于《国家中成药标准汇编》内科气血津液分册[1]，其执行标准号为WS-10677（ZD-0677）-2002，检验项目为甘草、黄柏的薄层色谱鉴别和盐酸小檗碱的薄层扫描含量测定，而盐酸小檗碱在黄连、黄柏、三颗针药材中均存在，以其作为含量测定指标不具有专属性。为进一步控制产品的内在质量，本试验采用高效液相色谱法（HPLC），以紫外检测器（UV）作为检测手段，对制剂中盐酸小檗碱及黄柏碱进行了含量测定研究，从而更加全面有效地控制利舒康胶囊中黄柏的质量。
1 仪器与试药
Agilent高效液相色谱仪（四元泵，DAD检测器，自动进样器），CP225D电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）。
利舒康胶囊样品由青海益欣药业有限责任公司提供；乙腈（色谱纯，Burdic&Jackson），水为Milli-Q超纯水，其余试剂为分析纯。对照品盐酸小檗碱（110713-200609）、黄柏碱（11895-201001）均购自中国药品生物制品检定所。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Waters Symmetry C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱；以0.1%磷酸（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱（0～25 min，32%B；25～26 min，50%B；26～35 min， 50%B）。流速：1 mL/min；检测波长：284 nm；进样量：10 ?L；理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于4000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液 精密称取盐酸小檗碱（10.28 mg）、黄柏碱对照品（10.02 mg），加甲醇制成每1 mL含盐酸小檗碱40 ?g、黄柏碱10 ?g的混合溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液 取本品0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理30 min（500 W，40 kHz），放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液用微孔滤膜（0.45 ?m）滤过，取续液，即得。
2.2.3 阴性对照溶液 取缺黄柏利舒康胶囊试样（自制），按“2.2.2”项下方法制备，得阴性对照溶液。
2.3 专属性试验
精密吸取“2.2”项下的3种溶液各10 ?L，注入液相色谱仪依法测定，在供试品色谱峰与对照品色谱峰相应保留时间的位置上，供试品有相同保留时间的色谱峰，阴性对照溶液无干扰。见图1。
2.4 线性关系考察
精密称取盐酸小檗碱对照品10.28 mg（含量98.1%），置50 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，配置系列浓度为0.040 34、0.121 02、0.201 69、0.403 39、0.605 01、1.008 47 ?g/mL的盐酸小檗碱对照品溶液，测定峰面积，以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，盐酸小檗碱回归方程为：Y=25837.0561X+20.330 8，r2=0.999 1，结果表明盐酸小檗碱在403.4～10 084.7 ?g范围内呈良好的线性关系。
精密称取黄柏碱对照品10.02 mg（含量84.4%），置100 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，配置系列浓度为0.169 137 6、0.338 275 2、0.507 412 8、0.845 688、2.537 064、4.228 44 ?g/mL的盐酸小檗碱对照品溶液测定峰面积，按色谱条件测定。以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，黄柏碱回归方程为：Y=13 156.676 3X+13.558 7，r2=0.9992，结果表明黄柏碱169.137 6～4228.44 ?g范围内呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验
取“2.2.1”项下对照品溶液10 ?L，连续进样5次，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果盐酸小檗碱、黄柏碱的RSD分别为0.6%、1.9%，表明精密度良好。
2.6 重复性试验
取同一批样品6份，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。结果盐酸小檗碱及黄柏碱含量的平均值（n=6）分别为每粒1.27、0.36 mg，RSD分别为1.3%、1.8%，结果表明本方法重复性较好。
2.7 稳定性试验
取同一样品的供试品溶液，置室温下放置，分别在0、2、4、6、8、12、16、24 h各进样10 ?L，测定盐酸小檗碱、黄柏碱RSD分别为1.5%、1.1%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。 2.8 加样回收率试验
精密称取已测盐酸小檗碱、黄柏碱含量的样品6份，每份各约0.25 g，分别加入盐酸小檗碱对照品、黄柏碱对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备，并测定含量。结果盐酸小檗碱、黄柏碱的平均回收率（n=6）分别为99.9%（RSD=1.7%）、95.5%（RSD=3.2%）。结果见表1。
2.9 样品含量测定
取10批样品，按含量测定方法测定，结果见表2。
3 讨论
本试验用二极管振列检测器在200～400 nm进行光谱扫描，盐酸小檗碱最大吸收波长为345 nm，黄柏碱最大吸收波长为284 nm，在345 nm下黄柏碱几乎没有吸收，因此选择284 nm作为检测波长对盐酸小檗碱和黄柏碱同时测定[1-2]。
以文献[3-5]报道的乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%三乙胺（磷酸调pH 2.5）、乙腈-0.1%磷酸（每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g）作为流动相，结果采用后者进行梯度洗脱使样品中盐酸小檗碱和黄柏碱在同一色谱条件下较好地得到分离。本试验增加了对利舒康胶囊中盐酸小檗碱及黄柏碱含量的测定，可以更全面地控制产品的质量，保证临床用药的安全有效。
供试品溶液制备中，分别采用甲醇、乙醇、50%乙醇及50%甲醇作为溶剂，对盐酸小檗碱及黄柏碱的含量测定结果没有显著差异，但以乙醇、50%乙醇及50%甲醇作为溶剂时色谱峰较多，故选用甲醇作为提取溶剂。分别采用超声、回流2种提取方式，并设定不同的提取时间，对盐酸小檗碱及黄柏碱的含量进行测定，结果表明超声30 min为最佳提取方式。
参考文献：
[1] 国家食品药品监督管理局.国家中成药标准汇编：内科气血津液分册[S].2002：65.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010：346.
[3] 潘超，张莉，王玉. HPLC法同时测定二妙丸中黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马丁和盐酸小檗碱的含量[J].中国生化药物杂志，2012， 33（4）：361-364.
[4] 陈天朝，翟来超.HPLC梯度洗脱测定黄柏中盐酸小檗碱与盐酸黄柏碱的含量[J].中医研究，2011，24（4）：23-25.
[5] 祝晨蔯，林朝展，莫建霞，等.HPLC法测定黄柏药材中小檗碱与黄柏碱的含量[J].中药新药与临床药理，2004，15（4）：262-264.
（收稿日期：2013-06-15，编辑：陈静）