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摘要：【目的】建立定性定量分析南極磷虾油中磷脂的高效液相色谱—蒸发光散射检测（HPLC-ELSD）方法，为南极磷虾油中磷脂的开发利用提供技术参考。【方法】比较氨基固相萃取柱和硅胶固相萃取柱对南极磷虾油中磷脂富集效果的影响，并研究Zorbax Rx-Sil柱和Chromolith Performance-Si柱及流动相对磷脂检测结果的影响。【结果】采用氨基固相萃取柱对南极磷虾油原液进行净化处理并富集磷脂，选用Chromolith Performance-Si柱，正己烷—异丙醇—乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，可定性定量分析南极磷虾油中的磷脂含量。南极磷虾油中主要含有磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）和溶血磷脂酰胆碱（LPC）3种磷脂。其中，PC含量最高，为28.73～38.52 g/100 g，占磷脂总含量的76.15%～92.22%;LPC含量为2.27～7.29 g/100 g，占磷脂总含量的5.41%～18.55%;PE含量最少，为0.30～2.69 g/100 g，占磷脂总含量的0.74%～7.36%。加标回收试验结果显示，3种磷脂的回收率在88.50%～109.49%，相对标准偏差（RSD）均小于10%。【结论】利用氨基固相萃取柱对南极磷虾油中磷脂进行纯化富集，具有良好的准确度和精密度，HPLC-ELSD可实现对南极磷虾油中磷脂的快速准确定性和定量分析。
关键词： 南极磷虾油;磷脂;HPLC-ELSD;定性分析;含量检测
中图分类号： S986.1;TS254.7 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）10-2293-07
Determination of phospholipids in Antarctic krill oil
by HPLC-ELSD
WEN Yi-xiao1，2， PENG Ji-xing2， GUO Ying-ying2， WANG Jing-yuan1，2，
ZUO Hong-he2， WANG Lian-zhu2*
（1College of Food Sciences & Technology，Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China; 2Yellow Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao， Shandong 266071， China）
Abstract：【Objective】High performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector method（HPLC-ELSD） for qualitative and quantitative analysis of phospholipids in Antarctic krill oil was developed to provide a technical reference for the development and utilization of phospholipids in Antarctic krill oil. 【Method】The effects of Sep-Pak Aminopropyl NH2 and Sep-Pak Silica on the enrichment of phospholipids in Antarctic krill oil were compared. The effects of Zorbax Rx-Sil column， Chromolith Performance-Si column and mobile phase on the result of phospholipids were compared. 【Result】The Antarctic krill oil was purified and enriched in phospholipids by Sep-Pak Aminopropyl NH2. The Chromolith Performance-Si column and the gradient elution of the mobile phase using n-hexane-isopropanol-acetic acid solution were used to qualitatively and quantitatively analyze the phospholipids in Antarctic krill oil. The Antarctic krill oil mainly contained three kinds of phospholipids：phosphatidyl ethanolamine（PE）， phosphatidylcholine（PC） and lysophosphatidylcholine（LPC）， among which the PC content was the highest（28.73-38.52 g/100 g）， accounting for 76.15%-92.22% of total phospholipids， the LPC content 2.27-7.29 g/100 g， accounting for 5.41%-18.55% of total phospholipids， and the PE content was was the lowest（0.30-2.69 g/100 g）， accounting for 0.74%-73.6% of total phospholipids， respectively. Recoveries of the three phospholipids ranged from 88.50% to 109.49%， and relative standard deviation（RSD） were less than 10%. 【Conclusion】The Sep-Pak Aminopropyl NH2 column can purify phospholipids in Antarctic krill oil very well， and the proposed method is simple and efficient. The HPLC-ELSD method can quickly and accurately analyze phospholipids in Antarctic krill oil in qualitative and quantitative analysis. Key words： Antarctic krill oil; phospholipids; HPLC-ELSD; qualitative analysis; content detection
0 引言
【研究意義】南极磷虾资源丰富，且富含蛋白质、磷脂及虾青素等营养成分。与鱼油中的甘油三酯不同，南极磷虾油中的大部分脂肪酸以磷脂形式存在（Lu et al.，2016），磷脂是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的最佳传输形式，因此南极磷虾油更容易被人体吸收，其开发利用价值极高（刘丽，2015）。磷脂是生物体细胞膜的重要组成成分，对机体膜功能和生理代谢有调节作用，广泛应用于食品、医药和化妆品等行业（Mcclements and Gumus，2016）。目前，磷脂的研究主要集中在大豆和蛋黄，水产品中磷脂的研究较少，关于南极磷虾油中磷脂的研究更少。因此，建立检测南极磷虾油中磷脂的方法，有利于完善南极磷虾油质量评价体系，对促进南极磷虾产业的发展具有重要意义。【前人研究进展】磷脂的分离纯化方法有柱层析法、有机溶剂法、超临界萃取法、化学沉淀法和膜分离法等（叶彬清等，2013），其中柱层析法是目前高纯度磷脂制备的主要方法，该方法操作简单，分离效果好，常用硅胶、氧化铝和硅藻土等为吸附剂，氯仿、甲醇、乙醚和丙酮等为洗脱剂。王琦等（2012）利用硅胶层析柱，以甲醇为洗脱剂从鲟鱼等水产品卵中纯化得到磷脂，回收率在95%以上;王磊等（2013）利用氧化铝层析柱对大豆卵磷脂粗品进行提纯，以乙醇作洗脱剂，得到磷脂酰胆碱（PC）的纯度和回收率分别为70.23%和83.07%。磷脂的检测方法有钼蓝比色法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）和核磁共振法（NMR）等。钼蓝比色法检测总磷脂含量，但无法对磷脂进行定性分析;TLC法可对磷脂进行定性分析，但影响薄层扫描定量的因素较多（颜晓航，2012），对磷脂的定量分析不准确;MS法主要用于鉴定脂质种类和磷脂中脂肪酸组成，对磷脂的定量分析较困难（Schiller et al.，2004）;NMR法是一种高效的无损检测技术，能对磷脂进行准确定性和定量分析，但所用设备价格昂贵，无法实现广泛应用。HPLC是目前磷脂分析最常用的方法，按检测器可分为高效液相色谱—示差检测（HPLC-RI）、高效液相色谱—紫外检测（HPLC-UV）和高效液相色谱—蒸发光散射检测（HPLC-ELSD），其中HPLC-UV的响应值与样品中的不饱和结构有关，主要用于分析大豆磷脂和蛋黄磷脂，不适合分析南极磷虾油中的磷脂;HPLC-RI和HPLC-ELSD都是通用型检测器，不受样品结构的影响，其响应值与样品质量成正比，但HPLC-RI受环境温度、流动相等的影响较大，灵敏度较低;ELSD的灵敏度和稳定性均较好，适用于不同磷脂的检测分析（Narváez-Rivas et al.，2011）。在南极磷虾油中磷脂的研究方面，Castro-Gómez等（2015）分析了南极磷虾油中的脂类，并对磷脂分子种类进行研究;陈康等（2017）提取了南极磷虾中的磷脂，并利用质谱鉴定其PC分子种;孙德伟等（2017）优化了南极磷虾的亚临界提取工艺，并对总磷脂含量进行分析;苏婷等（2018）采用NMR法对南极磷虾油种类和含量进行了检测分析。【本研究切入点】常规的磷脂分析方法不适合分析南极磷虾油中的磷脂，而HPLC-ELSD的响应值不受样品结构影响，已广泛应用于肉类及乳制品等多种食品中磷脂的检测（叶小敏等，2007;Rodríguez-Alcalá and Fontecha，2010），但国内鲜见采用HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂的研究报道。【拟解决的关键问题】采用固相萃取柱对南极磷虾油进行净化并富集磷脂，确定南极磷虾油的最佳净化条件，并以正己烷—异丙醇—乙酸水溶液为流动相，采用HPLC-ELSD对净化处理后的样品进行测定，实现对南极磷虾油中磷脂种类和含量的分析，为其开发利用提供技术参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
6种来自不同厂家的南极磷虾油（原液）分别编号为1#、2#、3#、4#、5#和6#;3种磷脂标准品[磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）和溶血磷脂酰胆碱（LPC）（纯度≥95%）]购自Sigma公司;氯仿、甲醇和乙醚购自国药集团化学试剂有限公司;色谱级乙酸、异丙醇和正己烷购自霍尼韦尔（中国）有限公司。主要仪器设备：氮吹仪购自Organomation公司;涡旋振荡器购自生工生物工程（上海）股份有限公司;氨基固相萃取柱（1000 mg/6 mL）和硅胶固相萃取柱（1000 mg/6 mL）均购自Waters公司;高效液相色谱仪为waters 2695，蒸发光散射检测器为waters 2424，色谱柱为Chromolith Performance-Si柱，购自默克公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品处理 选用氨基固相萃取柱和硅胶固相萃取柱为净化柱，分别以氯仿、氯仿—异丙醇（2∶1）、丙酮、乙醚—乙酸（72∶1）和甲醇为洗脱液，对磷脂进行净化处理。
固相萃取柱净化：取0.030 g左右的磷虾油，加入适量氯仿，涡旋混合。用氯仿活化氨基固相萃取柱，将含有油脂试样的氯仿移入固相萃取柱中，依次用4倍柱体积的氯仿/氯仿—异丙醇溶液（2∶1）、3倍柱体积的丙酮/乙醚—乙酸溶液（72∶1）、5倍柱体积的甲醇溶液洗脱，收集甲醇洗脱液，氮吹至干。氮吹残余物加入10 mL正己烷—异丙醇（2∶3）溶解，取上清液稀释至一定浓度，过孔径0.45 μm的有机相滤膜，用于液相色谱分析。
1. 2. 2 色谱条件 结合现有的磷脂检测方法和相关标准，选用Chromolith Performance-Si和Zorbax Rx-Sil两种色谱柱，选择3种磷脂分析方法，比较色谱柱和流动相对磷脂检测结果的影响。具体条件如下： 方法I：参考GB/T 35867—2018《粮油检验 卵磷脂中磷脂含量的测定 高效液相色谱蒸发光散射检测法》;
方法II：参考2015年版《中国药典》（国家药典委员会，2015）中大豆磷脂的检测;
方法III：流动相：A为正己烷（含0.04%三乙胺），B为异丙醇，C为13%乙酸水溶液;柱温25 ℃;载气压力40 psi;漂移管温度55 ℃。梯度洗脱程序见表1。
1. 2. 3 标准曲线制备 将PE、PC和LPC 3种磷脂标准品配制成质量浓度为0.1～0.6 mg/mL的溶液，单独进样并记录出峰时间，对南极磷虾油中的磷脂进行定性分析。将3种磷脂标准品配制成合适浓度的混合标准溶液，以磷脂质量浓度为横坐标、色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，采用外标法定量分析样品中的磷脂。
1. 3 数据处理
回收率和精密度：选用大豆油为空白基质，添加不同质量浓度的磷脂混合标准溶液，配成新样品。参照1.2.1处理加标样品，并根据拟合得到的标准曲线方程计算各标准品的加标回收率[回收率（%）=实测质量浓度/理论质量浓度×100]和精密度（相对标准偏差，RSD）。
南极磷虾油中磷脂的检测：采用HPLC-ELSD分析净化处理后的样品，根据磷脂标准品的保留时间确定磷脂种类，并根据拟合得到的标准曲线方程计算南极磷虾油中磷脂含量。
2 结果与分析
2. 1 净化条件的选择
采用不同净化方法处理南极磷虾油样品并比较磷脂的富集回收效果，南极磷虾油中磷脂含量测定结果见表2。由表2可知，南极磷虾油中主要含有PE、PC和LPC 3种磷脂;从净化萃取柱的角度来看，净化柱种类对磷脂的富集效果影响明显，其中两种固相萃取柱对PE的富集效果无显著差异（P>0.05，下同），但对PC和LPC的富集效果有显著差异（P<0.05，下同），可能是极性磷脂通过氢键和偶极相互作用吸附在硅胶固相萃取柱上，导致极性较强的PC和LPC不易洗脱下来（Avalli and Contarini，2005）;从洗脱液的角度来看，洗脱液1和洗脱液2对磷脂的富集效果均无显著差异，但在选用氨基固相萃取柱进行净化时，与含有丙酮的洗脱液相比，含有乙醚—乙酸（72∶1）的洗脱液能更好地将PE洗脱下来，可能是洗脱液中加入了乙酸，提供的酸性环境使PE与氨基固相萃取柱的结合减弱，从而使PE更易被洗脱。经综合分析，选用氨基固相萃取柱为净化柱，以氯仿—异丙醇（2∶1）、乙醚—乙酸（72∶1）和甲醇为洗脱液，对南极磷虾油中的磷脂进行净化富集处理。
2. 2 色谱条件的选择
由图1可知，采用方法I检测磷脂时，Zorbax Rx-Sil柱和Chromolith Performance-Si柱對磷脂的分离效果均不理想。采用方法II检测时，Zorbax Rx-Sil柱的磷脂分离效果良好，能在30 min内将PE、PC和LPC全部分离（图2-A）;Chromolith Performance-Si柱能在15 min内将PE、PC和LPC 3种磷脂分离，但PE色谱峰靠近溶剂峰，容易与溶剂峰重叠（图2-B）。由图3可知，采用方法III检测时，两种色谱柱均能在20 min内将各磷脂组分分离，其中Zorbax Rx-Sil柱色谱图中，LPC分离为LPC1和LPC2两个峰，可能是磷脂结构的多样性导致LPC出现分离;Chromolith Performance-Si柱的整体分离效果良好，且基线平稳背景噪声少，能在较短时间内将PE、PC和LPC全部分离。综合考虑，选用Chromolith Performance-Si色谱柱，以正己烷—异丙醇—乙酸水溶液为流动相（方法III）对南极磷虾油中磷脂进行分析。
2. 3 磷脂标准曲线及色谱分析结果
如图4所示，在本研究条件下，磷脂标准品混合液中的3种磷脂可得到很好地分离，且基线平稳，干扰少，能在15 min内完成一次分析。PE、PC和LPC标准品的浓度范围分别为10～180 μg/mL、30～540 μg/mL和20～360 μg/mL。以磷脂含量为横坐标、色谱峰峰面积为纵坐标，按y=axb对标准曲线进行拟合，分别得到3种磷脂的标准曲线方程（表3）。其中，PE检出限为10 μg/mL，定量限为20 μg/mL;PC检出限为30 μg/mL，定量限为45 μg/mL;LPC检出限为20 μg/mL，定量限为30 μg/mL。
2. 4 加标回收率和精密度
表4为3种磷脂的加标回收率及精密度情况。由表4可知，HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂的加标回收率范围为88.50%～109.49%，RSD小于10%，表明采用氨基固相萃取柱净化磷脂具有良好的回收率和精密度。
2. 5 南极磷虾油中磷脂分析结果
将净化处理后的3#样品进行HPLC-ELSD分析，结果如图5所示，南极磷虾油中主要含有PE、PC和LPC 3种磷脂，其中PC含量最高，且经净化处理后的样品基线平稳杂峰少。
根据标准曲线方程计算出6种成品南极磷虾油中磷脂的含量及其在总磷脂中的占比，结果（表5）显示，南极磷虾油中主要含有PE、PC和LPC 3种磷脂，各磷脂组分含量差异明显，其含量排序为PC>LPC>PE。以PC含量最高，为28.73～38.52 g/100 g，占磷脂总含量的76.15%～92.22%;LPC含量次之，为2.27～7.29 g/100 g，占磷脂总含量的5.41%～18.55%;PE含量最少，为0.30～2.69 g/100 g，占磷脂总含量的0.74%～7.36%。
3 讨论
磷脂按来源可分为动物来源、植物来源和微生物来源，动物性来源的磷脂主要来自蛋黄、脑部组织、肝脏及水产动物等，水产动物尤其是海洋动物含有丰富的DHA和EPA（崔益玮等，2018）。本研究结果显示，南极磷虾油中含有PE、PC和LPC 3种磷脂，且PC在磷脂总含量中的占比最高，在75.00%以上，高于PC在大豆磷脂和蛋黄磷脂中的占比（迟玉杰和林淑英，2002），与苏婷等（2018）的研究结果一致。 根据南极磷虾油中PC含量占比高的特点，本研究选用对PC富集效果好的氨基固相萃取柱作为净化柱，对南极磷虾油中的磷脂进行净化处理。关于检测器的选择，HPLC-UV和HPLC-ELSD均可用于检测磷脂，本研究的预试验分别用HPLC-UV和HPLC-ELSD对南极磷虾油中的磷脂进行检测分析，结果显示HPLC-UV只能检测到PE和PC两种磷脂，且由于目前市场上的磷脂标准品主要是大豆磷脂和蛋黄磷脂，这两种磷脂与南极磷虾油中磷脂的结构有明显差异，导致HPLC-UV的检测结果偏高。ELSD响应值与质量有关，不受样品结构的影响，综合比较后选择HPLC-ELSD检测南极磷虾油中的磷脂。与《中国药典》（国家药典委员会，2015）和GB/T 35867—2018《粮油检验 卵磷脂中磷脂含量的测定 高效液相色谱蒸发光散射检测法》中大豆磷脂的检测方法进行比较，结果显示，本研究所用的检测方法操作简单，分析时间短，磷脂分离效果好。由于每种磷脂含有多种分子结构，在某一色谱条件下，某种磷脂可能会分离出2个或多个色谱峰（王琦等，2012）。通过对南极磷虾油中磷脂进行分析，完善了南极磷虾油质量评价体系，为南极磷虾油磷脂检测方法的建立提供依据。
此外，南极磷虾油中磷脂含量与南极磷虾的生长状况和捕捞季节有关（聂玉晨等，2016;方兵等，2018），且不同生产工艺也会对南极磷虾油中磷脂种类和含量产生影响，故不同厂家生产的南极磷虾油（原液）中磷脂含量存在明显差异。
4 结论
利用氨基固相萃取柱对南极磷虾油中磷脂进行纯化富集，具有良好的准确度和精密度;采用HPLC-ELSD法同时测定南极磷虾油中磷脂的种类和含量，该方法基线平稳，能快速灵敏地对南极磷虾油中的磷脂进行定性和定量分析。
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（責任编辑 罗 丽）
关键词： 南极磷虾油;磷脂;HPLC-ELSD;定性分析;含量检测
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WEN Yi-xiao1，2， PENG Ji-xing2， GUO Ying-ying2， WANG Jing-yuan1，2，
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Abstract：【Objective】High performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector method（HPLC-ELSD） for qualitative and quantitative analysis of phospholipids in Antarctic krill oil was developed to provide a technical reference for the development and utilization of phospholipids in Antarctic krill oil. 【Method】The effects of Sep-Pak Aminopropyl NH2 and Sep-Pak Silica on the enrichment of phospholipids in Antarctic krill oil were compared. The effects of Zorbax Rx-Sil column， Chromolith Performance-Si column and mobile phase on the result of phospholipids were compared. 【Result】The Antarctic krill oil was purified and enriched in phospholipids by Sep-Pak Aminopropyl NH2. The Chromolith Performance-Si column and the gradient elution of the mobile phase using n-hexane-isopropanol-acetic acid solution were used to qualitatively and quantitatively analyze the phospholipids in Antarctic krill oil. The Antarctic krill oil mainly contained three kinds of phospholipids：phosphatidyl ethanolamine（PE）， phosphatidylcholine（PC） and lysophosphatidylcholine（LPC）， among which the PC content was the highest（28.73-38.52 g/100 g）， accounting for 76.15%-92.22% of total phospholipids， the LPC content 2.27-7.29 g/100 g， accounting for 5.41%-18.55% of total phospholipids， and the PE content was was the lowest（0.30-2.69 g/100 g）， accounting for 0.74%-73.6% of total phospholipids， respectively. Recoveries of the three phospholipids ranged from 88.50% to 109.49%， and relative standard deviation（RSD） were less than 10%. 【Conclusion】The Sep-Pak Aminopropyl NH2 column can purify phospholipids in Antarctic krill oil very well， and the proposed method is simple and efficient. The HPLC-ELSD method can quickly and accurately analyze phospholipids in Antarctic krill oil in qualitative and quantitative analysis. Key words： Antarctic krill oil; phospholipids; HPLC-ELSD; qualitative analysis; content detection
0 引言
【研究意義】南极磷虾资源丰富，且富含蛋白质、磷脂及虾青素等营养成分。与鱼油中的甘油三酯不同，南极磷虾油中的大部分脂肪酸以磷脂形式存在（Lu et al.，2016），磷脂是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）的最佳传输形式，因此南极磷虾油更容易被人体吸收，其开发利用价值极高（刘丽，2015）。磷脂是生物体细胞膜的重要组成成分，对机体膜功能和生理代谢有调节作用，广泛应用于食品、医药和化妆品等行业（Mcclements and Gumus，2016）。目前，磷脂的研究主要集中在大豆和蛋黄，水产品中磷脂的研究较少，关于南极磷虾油中磷脂的研究更少。因此，建立检测南极磷虾油中磷脂的方法，有利于完善南极磷虾油质量评价体系，对促进南极磷虾产业的发展具有重要意义。【前人研究进展】磷脂的分离纯化方法有柱层析法、有机溶剂法、超临界萃取法、化学沉淀法和膜分离法等（叶彬清等，2013），其中柱层析法是目前高纯度磷脂制备的主要方法，该方法操作简单，分离效果好，常用硅胶、氧化铝和硅藻土等为吸附剂，氯仿、甲醇、乙醚和丙酮等为洗脱剂。王琦等（2012）利用硅胶层析柱，以甲醇为洗脱剂从鲟鱼等水产品卵中纯化得到磷脂，回收率在95%以上;王磊等（2013）利用氧化铝层析柱对大豆卵磷脂粗品进行提纯，以乙醇作洗脱剂，得到磷脂酰胆碱（PC）的纯度和回收率分别为70.23%和83.07%。磷脂的检测方法有钼蓝比色法、薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）和核磁共振法（NMR）等。钼蓝比色法检测总磷脂含量，但无法对磷脂进行定性分析;TLC法可对磷脂进行定性分析，但影响薄层扫描定量的因素较多（颜晓航，2012），对磷脂的定量分析不准确;MS法主要用于鉴定脂质种类和磷脂中脂肪酸组成，对磷脂的定量分析较困难（Schiller et al.，2004）;NMR法是一种高效的无损检测技术，能对磷脂进行准确定性和定量分析，但所用设备价格昂贵，无法实现广泛应用。HPLC是目前磷脂分析最常用的方法，按检测器可分为高效液相色谱—示差检测（HPLC-RI）、高效液相色谱—紫外检测（HPLC-UV）和高效液相色谱—蒸发光散射检测（HPLC-ELSD），其中HPLC-UV的响应值与样品中的不饱和结构有关，主要用于分析大豆磷脂和蛋黄磷脂，不适合分析南极磷虾油中的磷脂;HPLC-RI和HPLC-ELSD都是通用型检测器，不受样品结构的影响，其响应值与样品质量成正比，但HPLC-RI受环境温度、流动相等的影响较大，灵敏度较低;ELSD的灵敏度和稳定性均较好，适用于不同磷脂的检测分析（Narváez-Rivas et al.，2011）。在南极磷虾油中磷脂的研究方面，Castro-Gómez等（2015）分析了南极磷虾油中的脂类，并对磷脂分子种类进行研究;陈康等（2017）提取了南极磷虾中的磷脂，并利用质谱鉴定其PC分子种;孙德伟等（2017）优化了南极磷虾的亚临界提取工艺，并对总磷脂含量进行分析;苏婷等（2018）采用NMR法对南极磷虾油种类和含量进行了检测分析。【本研究切入点】常规的磷脂分析方法不适合分析南极磷虾油中的磷脂，而HPLC-ELSD的响应值不受样品结构影响，已广泛应用于肉类及乳制品等多种食品中磷脂的检测（叶小敏等，2007;Rodríguez-Alcalá and Fontecha，2010），但国内鲜见采用HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂的研究报道。【拟解决的关键问题】采用固相萃取柱对南极磷虾油进行净化并富集磷脂，确定南极磷虾油的最佳净化条件，并以正己烷—异丙醇—乙酸水溶液为流动相，采用HPLC-ELSD对净化处理后的样品进行测定，实现对南极磷虾油中磷脂种类和含量的分析，为其开发利用提供技术参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
6种来自不同厂家的南极磷虾油（原液）分别编号为1#、2#、3#、4#、5#和6#;3种磷脂标准品[磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）和溶血磷脂酰胆碱（LPC）（纯度≥95%）]购自Sigma公司;氯仿、甲醇和乙醚购自国药集团化学试剂有限公司;色谱级乙酸、异丙醇和正己烷购自霍尼韦尔（中国）有限公司。主要仪器设备：氮吹仪购自Organomation公司;涡旋振荡器购自生工生物工程（上海）股份有限公司;氨基固相萃取柱（1000 mg/6 mL）和硅胶固相萃取柱（1000 mg/6 mL）均购自Waters公司;高效液相色谱仪为waters 2695，蒸发光散射检测器为waters 2424，色谱柱为Chromolith Performance-Si柱，购自默克公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 样品处理 选用氨基固相萃取柱和硅胶固相萃取柱为净化柱，分别以氯仿、氯仿—异丙醇（2∶1）、丙酮、乙醚—乙酸（72∶1）和甲醇为洗脱液，对磷脂进行净化处理。
固相萃取柱净化：取0.030 g左右的磷虾油，加入适量氯仿，涡旋混合。用氯仿活化氨基固相萃取柱，将含有油脂试样的氯仿移入固相萃取柱中，依次用4倍柱体积的氯仿/氯仿—异丙醇溶液（2∶1）、3倍柱体积的丙酮/乙醚—乙酸溶液（72∶1）、5倍柱体积的甲醇溶液洗脱，收集甲醇洗脱液，氮吹至干。氮吹残余物加入10 mL正己烷—异丙醇（2∶3）溶解，取上清液稀释至一定浓度，过孔径0.45 μm的有机相滤膜，用于液相色谱分析。
1. 2. 2 色谱条件 结合现有的磷脂检测方法和相关标准，选用Chromolith Performance-Si和Zorbax Rx-Sil两种色谱柱，选择3种磷脂分析方法，比较色谱柱和流动相对磷脂检测结果的影响。具体条件如下： 方法I：参考GB/T 35867—2018《粮油检验 卵磷脂中磷脂含量的测定 高效液相色谱蒸发光散射检测法》;
方法II：参考2015年版《中国药典》（国家药典委员会，2015）中大豆磷脂的检测;
方法III：流动相：A为正己烷（含0.04%三乙胺），B为异丙醇，C为13%乙酸水溶液;柱温25 ℃;载气压力40 psi;漂移管温度55 ℃。梯度洗脱程序见表1。
1. 2. 3 标准曲线制备 将PE、PC和LPC 3种磷脂标准品配制成质量浓度为0.1～0.6 mg/mL的溶液，单独进样并记录出峰时间，对南极磷虾油中的磷脂进行定性分析。将3种磷脂标准品配制成合适浓度的混合标准溶液，以磷脂质量浓度为横坐标、色谱峰峰面积为纵坐标绘制标准曲线，采用外标法定量分析样品中的磷脂。
1. 3 数据处理
回收率和精密度：选用大豆油为空白基质，添加不同质量浓度的磷脂混合标准溶液，配成新样品。参照1.2.1处理加标样品，并根据拟合得到的标准曲线方程计算各标准品的加标回收率[回收率（%）=实测质量浓度/理论质量浓度×100]和精密度（相对标准偏差，RSD）。
南极磷虾油中磷脂的检测：采用HPLC-ELSD分析净化处理后的样品，根据磷脂标准品的保留时间确定磷脂种类，并根据拟合得到的标准曲线方程计算南极磷虾油中磷脂含量。
2 结果与分析
2. 1 净化条件的选择
采用不同净化方法处理南极磷虾油样品并比较磷脂的富集回收效果，南极磷虾油中磷脂含量测定结果见表2。由表2可知，南极磷虾油中主要含有PE、PC和LPC 3种磷脂;从净化萃取柱的角度来看，净化柱种类对磷脂的富集效果影响明显，其中两种固相萃取柱对PE的富集效果无显著差异（P>0.05，下同），但对PC和LPC的富集效果有显著差异（P<0.05，下同），可能是极性磷脂通过氢键和偶极相互作用吸附在硅胶固相萃取柱上，导致极性较强的PC和LPC不易洗脱下来（Avalli and Contarini，2005）;从洗脱液的角度来看，洗脱液1和洗脱液2对磷脂的富集效果均无显著差异，但在选用氨基固相萃取柱进行净化时，与含有丙酮的洗脱液相比，含有乙醚—乙酸（72∶1）的洗脱液能更好地将PE洗脱下来，可能是洗脱液中加入了乙酸，提供的酸性环境使PE与氨基固相萃取柱的结合减弱，从而使PE更易被洗脱。经综合分析，选用氨基固相萃取柱为净化柱，以氯仿—异丙醇（2∶1）、乙醚—乙酸（72∶1）和甲醇为洗脱液，对南极磷虾油中的磷脂进行净化富集处理。
2. 2 色谱条件的选择
由图1可知，采用方法I检测磷脂时，Zorbax Rx-Sil柱和Chromolith Performance-Si柱對磷脂的分离效果均不理想。采用方法II检测时，Zorbax Rx-Sil柱的磷脂分离效果良好，能在30 min内将PE、PC和LPC全部分离（图2-A）;Chromolith Performance-Si柱能在15 min内将PE、PC和LPC 3种磷脂分离，但PE色谱峰靠近溶剂峰，容易与溶剂峰重叠（图2-B）。由图3可知，采用方法III检测时，两种色谱柱均能在20 min内将各磷脂组分分离，其中Zorbax Rx-Sil柱色谱图中，LPC分离为LPC1和LPC2两个峰，可能是磷脂结构的多样性导致LPC出现分离;Chromolith Performance-Si柱的整体分离效果良好，且基线平稳背景噪声少，能在较短时间内将PE、PC和LPC全部分离。综合考虑，选用Chromolith Performance-Si色谱柱，以正己烷—异丙醇—乙酸水溶液为流动相（方法III）对南极磷虾油中磷脂进行分析。
2. 3 磷脂标准曲线及色谱分析结果
如图4所示，在本研究条件下，磷脂标准品混合液中的3种磷脂可得到很好地分离，且基线平稳，干扰少，能在15 min内完成一次分析。PE、PC和LPC标准品的浓度范围分别为10～180 μg/mL、30～540 μg/mL和20～360 μg/mL。以磷脂含量为横坐标、色谱峰峰面积为纵坐标，按y=axb对标准曲线进行拟合，分别得到3种磷脂的标准曲线方程（表3）。其中，PE检出限为10 μg/mL，定量限为20 μg/mL;PC检出限为30 μg/mL，定量限为45 μg/mL;LPC检出限为20 μg/mL，定量限为30 μg/mL。
2. 4 加标回收率和精密度
表4为3种磷脂的加标回收率及精密度情况。由表4可知，HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂的加标回收率范围为88.50%～109.49%，RSD小于10%，表明采用氨基固相萃取柱净化磷脂具有良好的回收率和精密度。
2. 5 南极磷虾油中磷脂分析结果
将净化处理后的3#样品进行HPLC-ELSD分析，结果如图5所示，南极磷虾油中主要含有PE、PC和LPC 3种磷脂，其中PC含量最高，且经净化处理后的样品基线平稳杂峰少。
根据标准曲线方程计算出6种成品南极磷虾油中磷脂的含量及其在总磷脂中的占比，结果（表5）显示，南极磷虾油中主要含有PE、PC和LPC 3种磷脂，各磷脂组分含量差异明显，其含量排序为PC>LPC>PE。以PC含量最高，为28.73～38.52 g/100 g，占磷脂总含量的76.15%～92.22%;LPC含量次之，为2.27～7.29 g/100 g，占磷脂总含量的5.41%～18.55%;PE含量最少，为0.30～2.69 g/100 g，占磷脂总含量的0.74%～7.36%。
3 讨论
磷脂按来源可分为动物来源、植物来源和微生物来源，动物性来源的磷脂主要来自蛋黄、脑部组织、肝脏及水产动物等，水产动物尤其是海洋动物含有丰富的DHA和EPA（崔益玮等，2018）。本研究结果显示，南极磷虾油中含有PE、PC和LPC 3种磷脂，且PC在磷脂总含量中的占比最高，在75.00%以上，高于PC在大豆磷脂和蛋黄磷脂中的占比（迟玉杰和林淑英，2002），与苏婷等（2018）的研究结果一致。 根据南极磷虾油中PC含量占比高的特点，本研究选用对PC富集效果好的氨基固相萃取柱作为净化柱，对南极磷虾油中的磷脂进行净化处理。关于检测器的选择，HPLC-UV和HPLC-ELSD均可用于检测磷脂，本研究的预试验分别用HPLC-UV和HPLC-ELSD对南极磷虾油中的磷脂进行检测分析，结果显示HPLC-UV只能检测到PE和PC两种磷脂，且由于目前市场上的磷脂标准品主要是大豆磷脂和蛋黄磷脂，这两种磷脂与南极磷虾油中磷脂的结构有明显差异，导致HPLC-UV的检测结果偏高。ELSD响应值与质量有关，不受样品结构的影响，综合比较后选择HPLC-ELSD检测南极磷虾油中的磷脂。与《中国药典》（国家药典委员会，2015）和GB/T 35867—2018《粮油检验 卵磷脂中磷脂含量的测定 高效液相色谱蒸发光散射检测法》中大豆磷脂的检测方法进行比较，结果显示，本研究所用的检测方法操作简单，分析时间短，磷脂分离效果好。由于每种磷脂含有多种分子结构，在某一色谱条件下，某种磷脂可能会分离出2个或多个色谱峰（王琦等，2012）。通过对南极磷虾油中磷脂进行分析，完善了南极磷虾油质量评价体系，为南极磷虾油磷脂检测方法的建立提供依据。
此外，南极磷虾油中磷脂含量与南极磷虾的生长状况和捕捞季节有关（聂玉晨等，2016;方兵等，2018），且不同生产工艺也会对南极磷虾油中磷脂种类和含量产生影响，故不同厂家生产的南极磷虾油（原液）中磷脂含量存在明显差异。
4 结论
利用氨基固相萃取柱对南极磷虾油中磷脂进行纯化富集，具有良好的准确度和精密度;采用HPLC-ELSD法同时测定南极磷虾油中磷脂的种类和含量，该方法基线平稳，能快速灵敏地对南极磷虾油中的磷脂进行定性和定量分析。
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（責任编辑 罗 丽）