【摘 要】
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目的构建肠道病毒D68型（EV-D68）cDNA感染性克隆。方法利用聚合酶不完全引物延伸（Polymerase Incomplete Primer Extension，PIPE）法分别扩增EV-D68基因组cDNA片段与pBR322载体，得到的片段连接后测序，连接产物测序正确后作为载体与EV-D68的基因组的第2段扩增连接。以此类推，边扩增边连接，并测序，直到全基因组全部连接到pBR322上，在E
【机 构】
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100730 北京协和医学院&中国医学科学院病原生物学研究所,100730 北京协和医学院&中国医学科学院病原生物学研究所,
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目的构建肠道病毒D68型（EV-D68）cDNA感染性克隆。
方法利用聚合酶不完全引物延伸（Polymerase Incomplete Primer Extension，PIPE）法分别扩增EV-D68基因组cDNA片段与pBR322载体，得到的片段连接后测序，连接产物测序正确后作为载体与EV-D68的基因组的第2段扩增连接。以此类推，边扩增边连接，并测序，直到全基因组全部连接到pBR322上，在EV-D68基因组前面插入T7启动子后，经体外转录后的RNA转染RD细胞，转染后显微镜下连续观察是否出现细胞病变，并利用EV-D68的VP1特异性抗体进行免疫印迹确认。
结果转染后24 h在显微镜下可以观察到典型的肠道病毒细胞病变，病变细胞裂解液的免疫印迹得到特异的EV-D68的VP1条带，这些结果显示包装出EV-D68病毒，这些包装的病毒经传代实验显示可以连续传代。
结论成功构建EV-D68 cDNA感染性克隆。
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