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摘要：体细胞重编程是指分化的体细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性的状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。目前，体细胞重编程的方法主要有四种：核移植、特殊细胞间融合、特定培养条件下的细胞扩增以及病毒转染遗传因子诱导。利用特定多能性遗传基因导入受体细胞中制造而成的细胞称为诱导性多功能干细胞（induced human pluripotent stem，iPS）。人类胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）和人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）都拥有分化为不同类型干细胞的能力，但iPS细胞更为优越的是iPS可通过人类体细胞的“重设”获得。与ES细胞相比，iPS细胞的获得方法更简便，且不受伦理道德因素的约束，因此被认为是非常有用的研究工具，同时其在再生医学中也有着巨大的潜力。
关键词：诱导性多功能干细胞（iPS）重编程条件优化重编程机制再生医学
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）03-0002-02
1体细胞重编程研究发展
由于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES cells）的生物学特性及其在医疗领域的广阔应用前景，使其一直备受国内外医学科研工作者的青睐。但是，由于人类胚胎干细胞的取材触及伦理道德问题，所以已被很多国家法律明令禁止，相关的研究也因此陷入进退两难的境地。
2006年8月，日本的Yamanaka研究组利用反转录病毒载体，分别将24种转录因子按不同组合方式导入小鼠成纤维细胞，成功确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子可将终末分化的细胞重编程为iPS细胞[2]。2007年11月，该研究组又用同样的方法将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，从而正式掀起了iPS细胞应用于疑难疾病临床治疗的研究热潮。
2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。
2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。
2009年3月伊始，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破，英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则在《细胞》杂志上宣布，他们可以将iPS细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证由此获得的神经元细胞的基本功能不受影响。
2009年7月，中国科学家周琪和高绍荣等人利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。
2010年7月27日，日本京都大学iPS细胞研究所中川诚人讲师的研究小组发现，制取iPS细胞的转录基因c-Myc易致癌，应用目前的技术克隆出的活体小鼠中一年后的死亡率为70%，而其中有半数为得癌而死。该研究小组用一种结构相近的L-Myc的转录基因取代这一基因制取人体干细胞，得到的干细胞数量是之前的5倍，而且将这一技术应用于克隆活体小鼠实验发现，活体小鼠的死亡率降到了10%。
2iPS形成的细胞内机制浅析
最初的遗传研究显示同源转录因子Oct4、Nanog在早期发育和ES细胞判定中是至关重要的。它们在多能胚胎干细胞和囊胚期的内细胞团中都有表达。但是，最近的研究揭示，Nanog只是稳定胚胎干细胞的多能性状态而非维持其多能性。在ES细胞中，Oct4能与HMG-box转录因子Sox2形成异源二聚体共同作用于细胞的多能性。对Oct4，Sox2，Nanog在全基因组上调控基因的研究显示：①Oct，Sox2，Nanog结合在一起共同作用于各自的基因起始区促进转录，如此形成一个循环的自我调控环，从而维持蛋白表达的稳定，可促进多能性的维持；②三个因子常常共同募集到几百个特定的靶基因上，这也解释了为何诱导iPS需要多个基因；③Oct4，Sox2，和Nanog调控的基因有两类，一类被激活，另一类被沉默（激活的基因与多能性有关，沉默的基因与分化有关）。被Oct4，Sox和Nanog沉默的基因往往还募集一种抑制转录因子——PcG蛋白。PcG形成PRCs蛋白复合物家族。其中PRC2催化组蛋白H3K27甲基化，H3K27位的甲基化提供PRC1的结合位点，PRC1使染色体结构更紧密，同时抑制染色体重塑活性以维持基因的沉默状态；④三个因子促进特定microRNAs（miRNAs）的表达，研究证实miRNA在ES细胞基因调控中发挥重要的作用，但具体机制尚不清楚[1]。
总的来说，利用慢病毒转导方法转入细胞的诱导因子（Oct4，Sox2等）引起细胞内连续的随机的遗传事件，包括激活部分基因的表达或者抑制部分基因的表达等，而只在特定的敏感转入细胞中才随机发生重大的变化足够另体细胞诱导为iPS细胞。这样的重大变化包括什么呢？比如：①内源多能性基因，Oct4，Sox2，Nonag等基因的稳定足量表达；②形成iPS细胞必须的DNA修饰及染色体结构变化和修饰能够缓慢的足够完成；③被修改的这些DNA修饰及染色体结构变化和修饰必须在DNA复制即细胞增殖被保持等。
相比于Oct4，Sox2和Nonag，Klf4和c-Myc在重编程中的作用我们更不了解。一种论点是这两个因子使体细胞癌化，赋予MEFs无限快速增殖类似ES细胞的潜能；第二种论点是c-Myc更改MEFs的染色体结构使重编程因子更容易募集到它们的靶基因上；第三种论点c-Myc促进DNA复制，从而使体细胞有机会重置它的遗传表达状态。Klf4可在体细胞中辅助Oct4和Sox2激活关键ES细胞基因的表达。 3iPS细胞研究中存在的问题
2006年8月，日本的Yamanaka研究组利用反转录病毒载体，成功确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子可将终末分化的细胞重编程为iPS细胞。2007年11月，该研究组又用同样的方法将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，从而正式掀起了iPS细胞应用于疑难疾病临床治疗的研究热潮。
虽然iPS细胞的临床应用潜力巨大，但目前仍有许多亟待解决的科学问题困扰着它在医疗和制药领域的实际应用。这些问题主要包括：①iPS细胞的安全性不稳定。现阶段制备iPS细胞的主要方法是利用逆转录病毒或慢病毒载体携带转录因子转染细胞，使转录因子的编码基因整合到宿主细胞中诱导细胞的重编程。这种以插入基因诱导细胞重编程的制备方法，可能会因为破坏细胞基因组的完整性，或因为过量表达转入的外源基因，从而导致iPS细胞不能最终分化成熟甚至导致肿瘤的发生；②iPS细胞的制备效率不高且制备成本仍然很高；③对iPS细胞自我更新以及定向分化的调控机制知之甚少[5]。
4解决iPS细胞的安全性的方法
为了提高iPS细胞的安全性，科学家们做了很多努力：①避免使用致癌基因。目前，在不用c-Myc因子的情况下，只用Oct4、Sox2、Klf3也成功诱导了iPS细胞，或是利用另一种结构相近名为L-Myc因子替代c-Myc也取得了很好的效果；②利用某些体细胞中表达的内源因子，减少转录因子的使用数。③将已整合的外源基因从iPS细胞的基因组中清除。第一种方法利用Cre/LoxP重组系统去除整合的外源因子序列，然而该法仍可导致载体序列的残留，仍有可能造成插入突变。第二种方法是利用PiggyBac[16]转座子切除载体序列和外源因子序列，但该法要切除多个转座子，费时费力。④用小分子化合物替代转录因子。比如组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294最早被发现可替代Oct4或是组蛋白乙酰化酶抑制剂VPA与Essrb可替代c-Myc和Klf4；⑤利用腺病毒或质粒介导。Stadtfeld等采用腺病毒载体诱导小鼠产生iPS细胞，具体方法是用带有重编基因的腺病毒反复地感染小鼠肝细胞，最终成功地获得了小鼠，而Okita等则摒弃了腺病毒重复感染的方法，而是采用质粒携带的方法。其使用2种质粒，其中一种携带有Oct4、Klf4和Sox2基因，另一种携带c-Myc基因，然后重复转染小鼠胚胎成纤维细胞，也成功获得iPS细胞。但效率都很低。⑥直接导入重编程因子的蛋白；⑦寻找安全性较好的iPS供体细胞。
关键词：诱导性多功能干细胞（iPS）重编程条件优化重编程机制再生医学
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）03-0002-02
1体细胞重编程研究发展
由于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES cells）的生物学特性及其在医疗领域的广阔应用前景，使其一直备受国内外医学科研工作者的青睐。但是，由于人类胚胎干细胞的取材触及伦理道德问题，所以已被很多国家法律明令禁止，相关的研究也因此陷入进退两难的境地。
2006年8月，日本的Yamanaka研究组利用反转录病毒载体，分别将24种转录因子按不同组合方式导入小鼠成纤维细胞，成功确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子可将终末分化的细胞重编程为iPS细胞[2]。2007年11月，该研究组又用同样的方法将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，从而正式掀起了iPS细胞应用于疑难疾病临床治疗的研究热潮。
2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。
2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。
2009年3月伊始，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破，英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则在《细胞》杂志上宣布，他们可以将iPS细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证由此获得的神经元细胞的基本功能不受影响。
2009年7月，中国科学家周琪和高绍荣等人利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。
2010年7月27日，日本京都大学iPS细胞研究所中川诚人讲师的研究小组发现，制取iPS细胞的转录基因c-Myc易致癌，应用目前的技术克隆出的活体小鼠中一年后的死亡率为70%，而其中有半数为得癌而死。该研究小组用一种结构相近的L-Myc的转录基因取代这一基因制取人体干细胞，得到的干细胞数量是之前的5倍，而且将这一技术应用于克隆活体小鼠实验发现，活体小鼠的死亡率降到了10%。
2iPS形成的细胞内机制浅析
最初的遗传研究显示同源转录因子Oct4、Nanog在早期发育和ES细胞判定中是至关重要的。它们在多能胚胎干细胞和囊胚期的内细胞团中都有表达。但是，最近的研究揭示，Nanog只是稳定胚胎干细胞的多能性状态而非维持其多能性。在ES细胞中，Oct4能与HMG-box转录因子Sox2形成异源二聚体共同作用于细胞的多能性。对Oct4，Sox2，Nanog在全基因组上调控基因的研究显示：①Oct，Sox2，Nanog结合在一起共同作用于各自的基因起始区促进转录，如此形成一个循环的自我调控环，从而维持蛋白表达的稳定，可促进多能性的维持；②三个因子常常共同募集到几百个特定的靶基因上，这也解释了为何诱导iPS需要多个基因；③Oct4，Sox2，和Nanog调控的基因有两类，一类被激活，另一类被沉默（激活的基因与多能性有关，沉默的基因与分化有关）。被Oct4，Sox和Nanog沉默的基因往往还募集一种抑制转录因子——PcG蛋白。PcG形成PRCs蛋白复合物家族。其中PRC2催化组蛋白H3K27甲基化，H3K27位的甲基化提供PRC1的结合位点，PRC1使染色体结构更紧密，同时抑制染色体重塑活性以维持基因的沉默状态；④三个因子促进特定microRNAs（miRNAs）的表达，研究证实miRNA在ES细胞基因调控中发挥重要的作用，但具体机制尚不清楚[1]。
总的来说，利用慢病毒转导方法转入细胞的诱导因子（Oct4，Sox2等）引起细胞内连续的随机的遗传事件，包括激活部分基因的表达或者抑制部分基因的表达等，而只在特定的敏感转入细胞中才随机发生重大的变化足够另体细胞诱导为iPS细胞。这样的重大变化包括什么呢？比如：①内源多能性基因，Oct4，Sox2，Nonag等基因的稳定足量表达；②形成iPS细胞必须的DNA修饰及染色体结构变化和修饰能够缓慢的足够完成；③被修改的这些DNA修饰及染色体结构变化和修饰必须在DNA复制即细胞增殖被保持等。
相比于Oct4，Sox2和Nonag，Klf4和c-Myc在重编程中的作用我们更不了解。一种论点是这两个因子使体细胞癌化，赋予MEFs无限快速增殖类似ES细胞的潜能；第二种论点是c-Myc更改MEFs的染色体结构使重编程因子更容易募集到它们的靶基因上；第三种论点c-Myc促进DNA复制，从而使体细胞有机会重置它的遗传表达状态。Klf4可在体细胞中辅助Oct4和Sox2激活关键ES细胞基因的表达。 3iPS细胞研究中存在的问题
2006年8月，日本的Yamanaka研究组利用反转录病毒载体，成功确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子可将终末分化的细胞重编程为iPS细胞。2007年11月，该研究组又用同样的方法将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，从而正式掀起了iPS细胞应用于疑难疾病临床治疗的研究热潮。
虽然iPS细胞的临床应用潜力巨大，但目前仍有许多亟待解决的科学问题困扰着它在医疗和制药领域的实际应用。这些问题主要包括：①iPS细胞的安全性不稳定。现阶段制备iPS细胞的主要方法是利用逆转录病毒或慢病毒载体携带转录因子转染细胞，使转录因子的编码基因整合到宿主细胞中诱导细胞的重编程。这种以插入基因诱导细胞重编程的制备方法，可能会因为破坏细胞基因组的完整性，或因为过量表达转入的外源基因，从而导致iPS细胞不能最终分化成熟甚至导致肿瘤的发生；②iPS细胞的制备效率不高且制备成本仍然很高；③对iPS细胞自我更新以及定向分化的调控机制知之甚少[5]。
4解决iPS细胞的安全性的方法
为了提高iPS细胞的安全性，科学家们做了很多努力：①避免使用致癌基因。目前，在不用c-Myc因子的情况下，只用Oct4、Sox2、Klf3也成功诱导了iPS细胞，或是利用另一种结构相近名为L-Myc因子替代c-Myc也取得了很好的效果；②利用某些体细胞中表达的内源因子，减少转录因子的使用数。③将已整合的外源基因从iPS细胞的基因组中清除。第一种方法利用Cre/LoxP重组系统去除整合的外源因子序列，然而该法仍可导致载体序列的残留，仍有可能造成插入突变。第二种方法是利用PiggyBac[16]转座子切除载体序列和外源因子序列，但该法要切除多个转座子，费时费力。④用小分子化合物替代转录因子。比如组蛋白甲基转移酶G9a的抑制剂BIX-01294最早被发现可替代Oct4或是组蛋白乙酰化酶抑制剂VPA与Essrb可替代c-Myc和Klf4；⑤利用腺病毒或质粒介导。Stadtfeld等采用腺病毒载体诱导小鼠产生iPS细胞，具体方法是用带有重编基因的腺病毒反复地感染小鼠肝细胞，最终成功地获得了小鼠，而Okita等则摒弃了腺病毒重复感染的方法，而是采用质粒携带的方法。其使用2种质粒，其中一种携带有Oct4、Klf4和Sox2基因，另一种携带c-Myc基因，然后重复转染小鼠胚胎成纤维细胞，也成功获得iPS细胞。但效率都很低。⑥直接导入重编程因子的蛋白；⑦寻找安全性较好的iPS供体细胞。