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摘要：儿童SLE是儿童常见的肾脏病，其病理诊断及其分型对患儿的治疗，预后有着重要意义。本文通过介绍三种masson染色方法，病在肾穿标本中进行试验摸索，发现加入Bouin 后固定液可显著改善标本的染色效果，而用丽春红，酸性品红混合液染色的标本免疫复合物显示效果较好，但层次稍弱，而用变色酸2R染色的标本，颜色鲜艳，免疫复合物显示清晰，层次分明，是一种效果相对较好的方法，可能更加有助于对狼疮性肾炎的诊断。
关键词：儿童肾活检；Masson三色染色；狼疮性肾炎
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种全身性自身免疫性疾病，是一种常见的结缔组织病，累及肾脏则称为狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）。儿童肾脏累及率明显高于成人，为40%-90%[1]。儿童SLE起病大多以肾脏症状为首发表现，临床表现以肾炎肾病为主，病理类型以Ⅳ型最多[2]。
肾穿刺活检组织常规特殊染色有3种染色：过碘酸雪夫反应（PAS）、高碘酸-乌洛托品银（PASM）、Masson染色。其中M asson三色染色主要是用来观察肾小球嗜复红蛋白沉积物（免疫复合物）及肾脏内胶原纤维增生等，对狼疮性肾炎（LN）的诊断具有重要作用。
我们意识到传统的masson三色染色法[3]操作较繁琐，时间长，对肾小球内免疫复合物显色颜色浅淡，基底膜、系膜、胶原纤维及胞质、红细胞颜色对比不鲜艳。许多学者也对Masson三色染色法进行了各种各样的探索和改良。但由于各实验室条件及操作者的水平存在差异，因此改善的方法得不到广泛的认可和推广。现收集目前常用的几种Masson染色法及改良后的效果进行比较，对各实验条件及可行性进行分析比较，摸索找出一种效果显著又适合推广的方法，希望对儿童肾活检狼疮性肾炎诊断提供更好的诊断素材。
1 材料与方法
1.1 材料 收集南京市儿童医院临床住院患儿肾活检组织，经10% 福尔马林固定，常规脱水、透明、包埋，选取20例已明确诊断为Ⅲ型和Ⅳ型狼疮性肾炎的患儿肾穿刺标本病理诊断剩下的石蜡块，每块连续切2 μm 切片3张，分别采用三种不同方法进行Masson三色染色。
1.2 试剂：方法一：（1）重铬酸钾液：重铬酸钾2.5g、蒸馏水95ml、冰乙酸5ml。（2）天青石蓝液：天青石蓝1g、硫酸铁铵10g、纯甘油28ml、蒸馏水100ml。（3）mayer氏苏木素染液配方：结晶苏木素4g，蒸馏水1000ml，碘化钾0.3g，胺明矾或钾明矾50g，枸橼酸1g，水合氯醛75g，加热是明矾溶解，再加入苏木素，溶解后再加入枸橼酸、碘化钾及水合氯醛，摇荡使之全部溶解，呈紫红色，用前过滤。（4）丽春红液：丽春红1g、蒸馏水99ml、冰乙酸1ml。（5）酸性品红液：酸性品红1g、蒸馏水99ml、冰乙酸1ml。（6）磷钼酸液：磷钼酸1g、蒸馏水99 ml、冰乙酸1 ml。（7）亮绿液：亮绿1g、蒸馏水99ml、冰乙酸1ml。（8）0.2%冰乙酸溶液：（临用前配制）。
方法二：除Bouin 液（饱和苦味酸75ml，40%甲醛25ml 冰乙酸5ml），其余染液配制同方法一
方法三：改良法：（1）Bouin氏液（同方法二）（2）Masson红：磷钨酸0.8g溶于100ml蒸馏水后，加入变色酸2R 0.6g，充分溶解后加入1ml冰醋酸 （3）1%亮绿液：磷钨酸0.8g溶于100ml蒸馏水后，加入亮绿1g，充分溶解后加入1ml冰醋酸，（4）Weigert氏铁苏木素液：甲液：苏木素1g，无水酒精100ml乙液：30%三氯化铁4ml，蒸馏水100ml，纯盐酸1ml，临用前将甲乙两液等量混合。
1.3 染色步骤
方法一：（1）组织切片常规脱蜡至水、蒸馏水浸洗；（3）切片经重铬酸钾溶液氧化，60℃ 15 m in，切片流水冲洗10min，蒸馏水洗；（4）滴加天青石蓝液染10m in，蒸馏水冲洗。（5）苏木素10min，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化，流水冲洗10min；（6）滴加丽春红、酸性品红混合液（1：1，临用前配制）染20～ 30min；（7）0.2%乙酸水溶液洗涤，0.1% 磷钼酸分化，胶原纤维淡红色即可；（8）1%亮绿溶液，染1 ～ 2min，0.2%乙酸水溶液洗涤；（9）经95%乙醇、无水乙醇2次，脱水、透明、中性树胶封片。
方法二：切片充分脱蜡至水，重铬酸钾溶液氧化前，切片置入Bou in液进行第2次固定，常温下过夜或水浴56℃ 1 h，切片流水冲洗至黄色消失，蒸馏水洗；剩余步骤同方法一
方法三：（1）切片常规脱蜡至水；（2）切片置入Bouin液进行第2次固定，水浴56℃1h。切片流水冲洗至黄色消失，蒸馏水洗；（3）weiger氏苏木素染核15min，自来水冲洗，0.3%盐酸-酒精分化数秒，自来水水洗；（4）Scott液反蓝，自来水洗10min，蒸馏水洗；（6）Masson红30秒，水洗数秒；（6）0.5%亮绿30秒，水洗数秒，镜下控制调色；（7）95%酒精、无水酒精快速脱水；（8）苯酚二甲苯液及二甲苯液透明，封片。
2.结果
方法一染色，基底膜、系膜、胶原纤维呈暗绿色，胞质、红细胞呈暗红色，免疫复合物显示不明显（图A）；与方法一相比，后两者切片颜色更鲜艳，方法二染色中，基底膜、系膜、胶原纤维呈淡绿色，肾小球、肾小管胞质及系膜区呈深红色，细胞核呈蓝褐色，三色层次感稍弱，而免疫复合物呈玫红色，较易辨认（图B）；而方法三染色中，肾小球基底膜沉积物（免疫复合物）呈橘红色，基底膜、系膜、胶原纤维呈鲜绿色，肾小管管腔、胞质、红细胞呈鲜红色，细胞核呈蓝褐色，对比显著（图C）。
图A 肾小球基底膜、系膜、胶原纤维呈暗绿色，胞质、红细胞呈暗红色，免疫复合物显示不明显；图B肾小球基底膜、系膜、胶原纤维呈淡绿色，肾小球、肾小管胞质及系膜区呈深红色，细胞核呈蓝褐色，三色层次感稍弱，而免疫复合物呈玫红色，较易辨认；图C肾小球基底膜沉积物（免疫复合物）呈橘红色，基底膜、系膜、胶原纤维呈鲜绿色，肾小管管腔、胞质、红细胞呈鲜红色，细胞核呈蓝褐色，对比显著。 3.讨论
LN作为SLE最重要的并发症之一，严重影响SLE患者的预后，因此对小儿狼疮性肾炎的的诊断及病理分型及其重要，LN患儿的肾脏病理变化复杂多样，但肾小球内皮下、系膜区或上皮下或基膜内的免疫复合物沉积，及“白金耳”的形成仍被视为具有诊断意义的病理变化[4]。
Masson三色法染色原理：是利用三种阴离子染料混合后一起或先后作用而完成鉴别染色的。这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。根据组织不同的渗透性能，选择分子大小不同的阴离子染料进行染色，便可把不同组织成分显示出来[5]。常用作胶原纤维染色的几种阴离子染料的分子量由小到大分别是：
丽春红（红色），分子量：480.42
酸性品红（红色），分子量：585.53
亮绿（绿色），分子量：792.72
变色酸2R（红色），分子量：468.36
红细胞对阴离子染料的渗透性最小，肌纤维与胞质次之，而胶原纤维具有最大的渗透性[6]。因此在Masson氏法中I型、III型胶原（GBM、TBM、系膜基质及肾间质）呈绿色（被亮绿所染）；嗜复红蛋白、肾小管胞质、红细胞呈红色（被变色酸2R、酸性品红或丽春红所染），胶原纤维呈蓝色（被苯胺蓝所染）或绿色。
Masson染色的注意事项：1.组织用Bouin氏液或Zenker氏液固定为佳。如已用10%甲醛液固定，切片可在脱蜡至水后，再放入Bouin氏液室温作用一晚，或56℃作用1h，然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色。2.铁苏木素染核[5]。三色染色效果的成效关键在于组织对固定液的选择和显微镜下的调色技术的发挥[7]。Bouin固定液以苦味酸为主要溶剂，能沉淀组织中一切蛋白质，保持组织结构完整。苦味酸固定的组织密度疏松，保持组织结构孔隙宽、渗透性高的特性，有利于丽春红、酸性品红、亮绿等大分子染料对组织的浸透。因此，与未用Bouin固定液固定的组织相比，胶原纤维在系膜区、基底膜和沉淀复合物以及肾小管细胞的刷状缘和基部纵纹均显示更加清晰[7]。
Masson三色法应用的理想状态是各种组织成分的鲜明体现。方法三中的Masson三色染色法充分考虑到了这一重要性，其中用变色酸2R代替了酸性品红和丽春红，因变色酸2R分子量相较酸性品红和丽春红而言较小，对组织的穿透力更强，红细胞、细胞质及免疫复合物的鲜艳度得以明显提升。同时亮绿液中加入磷钨酸，使胶原纤维着色更鲜艳，并减少背景着色，使背景更清晰，最终使肾小球系膜区绿色背景中，免疫复合物呈橘红色；方法三中还改用weigert氏苏木素液染核[1]，weigert氏苏木素mayer氏苏木素液均为铁苏木素，而mayer苏木素液需与天青石蓝液结合，才具有较强抗酸作用，染核效果才较好。我们用水洗来代替磷钼酸[8]进行分化调色，不仅可以洗脱过染的背景中的红和绿，还能使细胞核在碱性自来水条件下反蓝，这就使得红、绿、蓝三色着色更鲜艳，对比更清晰。因此方法三的Masson三色染色对多种组织成分显色对比清晰、艳丽，不仅能准确显示肾小球基底膜、系膜基质、胶原纤维和有无免疫复合物的沉积，并且易识别沉积的部位和病变范围，对肾脏疾病的病理诊断和描述具有很大的技术支持作用，亦适用于所有的常规结缔组织特殊染色。此法简化了操作步骤，减少了染料的使用品种和剂量，减轻了对环境的污染，具有推广应用价值。
参考文献：
[1]刘婷，赵晓东.系统性红斑狼疮111例患儿临床及病情活动分析[J].实用儿科临床杂志，2010，25（21）：1648—1650.
[2]Wen YK，Renal biopsy findings in new—onset systemic lupus erythematosus with clinical renal disease[J].Int Urol Nephrol，2011，43（3）：801- 806.
[3]胥维勇，杨群，范小莉. 介绍一种改良Masson 三色染色法[J]. 诊断病理学杂志，2005，12（1）：63
[4]邹万忠，肾活检病理学 北京大学医学出版社[M]，2009：23-24.
[5]凌启波. 实用病理特殊染色和组化技术[M]. 广州：广东高等教育出版社，1989：4-9.
[6]王伯，李玉松，黄高，等.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：142-143.
[7]郑智勇，李京榕.肾穿刺组织固定液的改进.中华病理学杂志[J]，1994，23：119。
[8]PASM-Masson 染色法在肾穿刺活检特殊染色中的应用与体会. 李敏，姚梅宏，曾玲，郑智勇 临床与实验病理学杂志[J].2014，30（6）：693-694.
关键词：儿童肾活检；Masson三色染色；狼疮性肾炎
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种全身性自身免疫性疾病，是一种常见的结缔组织病，累及肾脏则称为狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）。儿童肾脏累及率明显高于成人，为40%-90%[1]。儿童SLE起病大多以肾脏症状为首发表现，临床表现以肾炎肾病为主，病理类型以Ⅳ型最多[2]。
肾穿刺活检组织常规特殊染色有3种染色：过碘酸雪夫反应（PAS）、高碘酸-乌洛托品银（PASM）、Masson染色。其中M asson三色染色主要是用来观察肾小球嗜复红蛋白沉积物（免疫复合物）及肾脏内胶原纤维增生等，对狼疮性肾炎（LN）的诊断具有重要作用。
我们意识到传统的masson三色染色法[3]操作较繁琐，时间长，对肾小球内免疫复合物显色颜色浅淡，基底膜、系膜、胶原纤维及胞质、红细胞颜色对比不鲜艳。许多学者也对Masson三色染色法进行了各种各样的探索和改良。但由于各实验室条件及操作者的水平存在差异，因此改善的方法得不到广泛的认可和推广。现收集目前常用的几种Masson染色法及改良后的效果进行比较，对各实验条件及可行性进行分析比较，摸索找出一种效果显著又适合推广的方法，希望对儿童肾活检狼疮性肾炎诊断提供更好的诊断素材。
1 材料与方法
1.1 材料 收集南京市儿童医院临床住院患儿肾活检组织，经10% 福尔马林固定，常规脱水、透明、包埋，选取20例已明确诊断为Ⅲ型和Ⅳ型狼疮性肾炎的患儿肾穿刺标本病理诊断剩下的石蜡块，每块连续切2 μm 切片3张，分别采用三种不同方法进行Masson三色染色。
1.2 试剂：方法一：（1）重铬酸钾液：重铬酸钾2.5g、蒸馏水95ml、冰乙酸5ml。（2）天青石蓝液：天青石蓝1g、硫酸铁铵10g、纯甘油28ml、蒸馏水100ml。（3）mayer氏苏木素染液配方：结晶苏木素4g，蒸馏水1000ml，碘化钾0.3g，胺明矾或钾明矾50g，枸橼酸1g，水合氯醛75g，加热是明矾溶解，再加入苏木素，溶解后再加入枸橼酸、碘化钾及水合氯醛，摇荡使之全部溶解，呈紫红色，用前过滤。（4）丽春红液：丽春红1g、蒸馏水99ml、冰乙酸1ml。（5）酸性品红液：酸性品红1g、蒸馏水99ml、冰乙酸1ml。（6）磷钼酸液：磷钼酸1g、蒸馏水99 ml、冰乙酸1 ml。（7）亮绿液：亮绿1g、蒸馏水99ml、冰乙酸1ml。（8）0.2%冰乙酸溶液：（临用前配制）。
方法二：除Bouin 液（饱和苦味酸75ml，40%甲醛25ml 冰乙酸5ml），其余染液配制同方法一
方法三：改良法：（1）Bouin氏液（同方法二）（2）Masson红：磷钨酸0.8g溶于100ml蒸馏水后，加入变色酸2R 0.6g，充分溶解后加入1ml冰醋酸 （3）1%亮绿液：磷钨酸0.8g溶于100ml蒸馏水后，加入亮绿1g，充分溶解后加入1ml冰醋酸，（4）Weigert氏铁苏木素液：甲液：苏木素1g，无水酒精100ml乙液：30%三氯化铁4ml，蒸馏水100ml，纯盐酸1ml，临用前将甲乙两液等量混合。
1.3 染色步骤
方法一：（1）组织切片常规脱蜡至水、蒸馏水浸洗；（3）切片经重铬酸钾溶液氧化，60℃ 15 m in，切片流水冲洗10min，蒸馏水洗；（4）滴加天青石蓝液染10m in，蒸馏水冲洗。（5）苏木素10min，流水冲洗，1%盐酸乙醇分化，流水冲洗10min；（6）滴加丽春红、酸性品红混合液（1：1，临用前配制）染20～ 30min；（7）0.2%乙酸水溶液洗涤，0.1% 磷钼酸分化，胶原纤维淡红色即可；（8）1%亮绿溶液，染1 ～ 2min，0.2%乙酸水溶液洗涤；（9）经95%乙醇、无水乙醇2次，脱水、透明、中性树胶封片。
方法二：切片充分脱蜡至水，重铬酸钾溶液氧化前，切片置入Bou in液进行第2次固定，常温下过夜或水浴56℃ 1 h，切片流水冲洗至黄色消失，蒸馏水洗；剩余步骤同方法一
方法三：（1）切片常规脱蜡至水；（2）切片置入Bouin液进行第2次固定，水浴56℃1h。切片流水冲洗至黄色消失，蒸馏水洗；（3）weiger氏苏木素染核15min，自来水冲洗，0.3%盐酸-酒精分化数秒，自来水水洗；（4）Scott液反蓝，自来水洗10min，蒸馏水洗；（6）Masson红30秒，水洗数秒；（6）0.5%亮绿30秒，水洗数秒，镜下控制调色；（7）95%酒精、无水酒精快速脱水；（8）苯酚二甲苯液及二甲苯液透明，封片。
2.结果
方法一染色，基底膜、系膜、胶原纤维呈暗绿色，胞质、红细胞呈暗红色，免疫复合物显示不明显（图A）；与方法一相比，后两者切片颜色更鲜艳，方法二染色中，基底膜、系膜、胶原纤维呈淡绿色，肾小球、肾小管胞质及系膜区呈深红色，细胞核呈蓝褐色，三色层次感稍弱，而免疫复合物呈玫红色，较易辨认（图B）；而方法三染色中，肾小球基底膜沉积物（免疫复合物）呈橘红色，基底膜、系膜、胶原纤维呈鲜绿色，肾小管管腔、胞质、红细胞呈鲜红色，细胞核呈蓝褐色，对比显著（图C）。
图A 肾小球基底膜、系膜、胶原纤维呈暗绿色，胞质、红细胞呈暗红色，免疫复合物显示不明显；图B肾小球基底膜、系膜、胶原纤维呈淡绿色，肾小球、肾小管胞质及系膜区呈深红色，细胞核呈蓝褐色，三色层次感稍弱，而免疫复合物呈玫红色，较易辨认；图C肾小球基底膜沉积物（免疫复合物）呈橘红色，基底膜、系膜、胶原纤维呈鲜绿色，肾小管管腔、胞质、红细胞呈鲜红色，细胞核呈蓝褐色，对比显著。 3.讨论
LN作为SLE最重要的并发症之一，严重影响SLE患者的预后，因此对小儿狼疮性肾炎的的诊断及病理分型及其重要，LN患儿的肾脏病理变化复杂多样，但肾小球内皮下、系膜区或上皮下或基膜内的免疫复合物沉积，及“白金耳”的形成仍被视为具有诊断意义的病理变化[4]。
Masson三色法染色原理：是利用三种阴离子染料混合后一起或先后作用而完成鉴别染色的。这与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关。根据组织不同的渗透性能，选择分子大小不同的阴离子染料进行染色，便可把不同组织成分显示出来[5]。常用作胶原纤维染色的几种阴离子染料的分子量由小到大分别是：
丽春红（红色），分子量：480.42
酸性品红（红色），分子量：585.53
亮绿（绿色），分子量：792.72
变色酸2R（红色），分子量：468.36
红细胞对阴离子染料的渗透性最小，肌纤维与胞质次之，而胶原纤维具有最大的渗透性[6]。因此在Masson氏法中I型、III型胶原（GBM、TBM、系膜基质及肾间质）呈绿色（被亮绿所染）；嗜复红蛋白、肾小管胞质、红细胞呈红色（被变色酸2R、酸性品红或丽春红所染），胶原纤维呈蓝色（被苯胺蓝所染）或绿色。
Masson染色的注意事项：1.组织用Bouin氏液或Zenker氏液固定为佳。如已用10%甲醛液固定，切片可在脱蜡至水后，再放入Bouin氏液室温作用一晚，或56℃作用1h，然后流水冲洗切片至黄色消失再进行染色。2.铁苏木素染核[5]。三色染色效果的成效关键在于组织对固定液的选择和显微镜下的调色技术的发挥[7]。Bouin固定液以苦味酸为主要溶剂，能沉淀组织中一切蛋白质，保持组织结构完整。苦味酸固定的组织密度疏松，保持组织结构孔隙宽、渗透性高的特性，有利于丽春红、酸性品红、亮绿等大分子染料对组织的浸透。因此，与未用Bouin固定液固定的组织相比，胶原纤维在系膜区、基底膜和沉淀复合物以及肾小管细胞的刷状缘和基部纵纹均显示更加清晰[7]。
Masson三色法应用的理想状态是各种组织成分的鲜明体现。方法三中的Masson三色染色法充分考虑到了这一重要性，其中用变色酸2R代替了酸性品红和丽春红，因变色酸2R分子量相较酸性品红和丽春红而言较小，对组织的穿透力更强，红细胞、细胞质及免疫复合物的鲜艳度得以明显提升。同时亮绿液中加入磷钨酸，使胶原纤维着色更鲜艳，并减少背景着色，使背景更清晰，最终使肾小球系膜区绿色背景中，免疫复合物呈橘红色；方法三中还改用weigert氏苏木素液染核[1]，weigert氏苏木素mayer氏苏木素液均为铁苏木素，而mayer苏木素液需与天青石蓝液结合，才具有较强抗酸作用，染核效果才较好。我们用水洗来代替磷钼酸[8]进行分化调色，不仅可以洗脱过染的背景中的红和绿，还能使细胞核在碱性自来水条件下反蓝，这就使得红、绿、蓝三色着色更鲜艳，对比更清晰。因此方法三的Masson三色染色对多种组织成分显色对比清晰、艳丽，不仅能准确显示肾小球基底膜、系膜基质、胶原纤维和有无免疫复合物的沉积，并且易识别沉积的部位和病变范围，对肾脏疾病的病理诊断和描述具有很大的技术支持作用，亦适用于所有的常规结缔组织特殊染色。此法简化了操作步骤，减少了染料的使用品种和剂量，减轻了对环境的污染，具有推广应用价值。
参考文献：
[1]刘婷，赵晓东.系统性红斑狼疮111例患儿临床及病情活动分析[J].实用儿科临床杂志，2010，25（21）：1648—1650.
[2]Wen YK，Renal biopsy findings in new—onset systemic lupus erythematosus with clinical renal disease[J].Int Urol Nephrol，2011，43（3）：801- 806.
[3]胥维勇，杨群，范小莉. 介绍一种改良Masson 三色染色法[J]. 诊断病理学杂志，2005，12（1）：63
[4]邹万忠，肾活检病理学 北京大学医学出版社[M]，2009：23-24.
[5]凌启波. 实用病理特殊染色和组化技术[M]. 广州：广东高等教育出版社，1989：4-9.
[6]王伯，李玉松，黄高，等.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社，2000：142-143.
[7]郑智勇，李京榕.肾穿刺组织固定液的改进.中华病理学杂志[J]，1994，23：119。
[8]PASM-Masson 染色法在肾穿刺活检特殊染色中的应用与体会. 李敏，姚梅宏，曾玲，郑智勇 临床与实验病理学杂志[J].2014，30（6）：693-694.