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摘 要：为了解规模化肉鸡养殖场致病性大肠杆菌的耐药性与致病性，并为规模化养殖场提供大肠杆菌病的防治参考。从山西省某规模化肉鸡养殖场采集病死鸡病料，进行大肠杆菌的分离培养、生化鉴定、药敏试验、致病性试验。结果表明：分离到1株血清型为O2的致病性大肠杆菌，分离菌对头孢类、喹诺酮类等8种药物耐药，对妥布霉素、阿米卡星高敏，对强力霉素、氧氟沙星中敏。结论：分离株肉鸡源大肠杆菌具有多重耐药性和较强的致病性，季节交替要加强鸡场饲养管理。
关键词：肉鸡;大肠杆菌;分离鉴定;药敏试验;致病性分析
中图分类号：S858.314.4+3 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2020）5-0045-04
2019年5月山西省晋中市某肉鸡养殖场饲养的30000只33日龄科宝肉鸡出现鸡只死亡增多的现象，病死鸡剖检可见气囊浑浊，心包积液，腹腔内有纤维素样渗出物，肠粘膜充血，偶见出血，盲肠扁桃体出血。初步诊断为大肠杆菌感染，无菌采取病死鸡的肝组织、肺组织样品，冰盒保存，送实验室12h内进行细菌的分离培养鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料 检测样品，为某肉鸡养殖场送检的病死鸡;试验用培养基，购自青岛宾得生物技术有限公司，实验室现配现用;细菌微量生化反应管和药敏试纸，购自杭州滨和微生物试剂有限公司;PCR试剂，购自北京美吉桑格生物医药科技有限公司;大肠杆菌“O”抗原单价血清，中国兽医药品监察所生产。试验动物，1日龄商品代雏鸡20只，山西省太原市北格种鸡场馈赠。
1.2 细菌分离培养 称取0.1g的病死鸡肺组织样品，生理盐水梯度稀释，接种于麦康凯培养基，温箱37℃培养过夜。挑选粉红色单菌落，再次接种于伊红美蓝琼脂，37℃过夜培养。挑选有金属光泽的菌落接种于肉汤，振荡培养后温箱过夜，染色镜检。
1.3 生化鉴定 按照《伯杰氏细菌鉴定手册》[1]，将肉汤培养基中的菌液，分别滴入生化反应管鉴定。
1.4 PCR鉴定 根据大肠杆菌16S rDNA的保守基因片段，设计引物，引物序列与反应体系参照文献方法进行[2]。
1.5 血清型鉴定 采用大肠杆菌单因子标准阳性血清，与分离菌株的菌体抗原进行玻璃板凝集反应。
1.6 药物敏感性试验 采用K-B纸片扩散法进行药物的敏感性试验，参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLC）标准进行操作与判断。
1.7 致病性试验 采用腹腔注射法，将调到3×108CFU/mL的菌液，注射7日龄雏鸡0.5mL/只，设不注射和注射生理盐水的对照组两个，每组6只雏鸡。观察雏鸡死亡情况，并取死亡鸡只病变组织，分离菌株与原菌液菌进行比较。
2 结果
2.1 细菌的分离培养 细菌的分离培养结果见图1。
样品液在麦康凯平板长出光滑、红色的菌落，（图1A），在伊红美蓝琼脂上长出了带有金属光泽的菌落，划线分离出一株菌株，命名为JZE01。将JZE01在营养肉汤里培养后出现浑浊，革兰氏染色镜检为红色的两端钝圆的长杆菌（图1B），符合大肠杆菌形态。
2.2 生化鉴定 JZE01菌株生化反应鉴定结果见表1。
由表1可知，该菌可以发酵糖，吲哚试验、甲基红试验阳性，不产生H2S，初步鉴定JZE01为大肠杆菌。
2.3 PCR鉴定 将JZE01菌株菌液进行16S rDNA基因扩增得到与预期基本一致的片段，约1450bp。回收测序，进行BLAST比对，与大肠杆菌同源性为99.92%。
2.4 血清型鑒定 利用“O”抗原标准血清进行鉴定，JZE01菌定型为O2。
2.5 药敏试验 选取常见的抗菌药物12种，对菌株JZE01进行药物敏感性试验，试验结果显示JZE01株对头孢类、喹诺酮类等8种药物耐药，对妥布霉素、阿米卡星高敏，对强力霉素、氧氟沙星中敏，表明分离株JZE01对多种药物具有耐药性。药敏试验结果见表2。
2.6 致病性试验 腹腔注射菌苗后的雏鸡，6h后出现精神不振、怕冷扎堆、食欲降低甚至废绝，很少饮水，并出现白色稀粪，在21、33、69h检查各死亡2只，剖检病死鸡发现气囊浑浊增厚，心包有积液，包膜增厚，有纤维素性渗出物，肠道出血，有粘性渗出物。对照组生长正常，未出现任何症状。回收死亡鸡组织，分离到与原接种菌一致的菌株。
3 讨论
大肠杆菌是一种条件性致病菌，在规模化肉鸡养殖场的鸡舍中，从舍内环境、裸露饲料、饮水和粪便等来源中均可以分离到该菌，它的血清型复杂，其中的致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli， APEC）给肉鸡养殖业带来了严重的危害，特别是当肉鸡群发生病毒性疾病或者支原体病时，可以造成肉鸡死淘率增加[2-4]。据调查规模化白羽肉鸡养殖场发生大肠杆菌病的主要原因：一是环境因素突变引起的鸡群应激，当外界气温骤升骤降或者刮起大风，鸡舍没有及时调节通风小窗的大小，造成局部温度高于或者低于设定温度，时间长久导致鸡群抵抗力下降，诱发大肠杆菌病;二是鸡场发生其它疫病的时候，比如发生支原体病或者新城疫时，鸡群免疫功能降低，发生与大肠杆菌病的混合感染或者继发感染;三是饲料和饮水中含有大肠杆菌，规模化的鸡场应该定期对饲料和饮水进行大肠杆菌指标检测，一旦发现指数超标，就要停止使用，在清除原因后再进行饲喂或者饮水;四是粪便中的大肠杆菌引起，鸡的粪便中含有致病性大肠杆菌，可以通过其它途径感染鸡群，这与粪便清理的速度密切相关，要求鸡舍每日清理粪便，特别是在炎热的夏季。 5月正是山西省春夏交替季节，风大干燥、气温变换不定、昼夜温差大。白羽肉鸡养殖到了后期，体型較大，如果不注意及时加大通风量、开启湿帘或者调节通风小窗，就会造成鸡舍短暂性的局部气温忽高忽低。如果鸡舍局部气温升高，会加大鸡只的喘息，使得CO2浓度升高，造成鸡群应激抵抗力下降;温度降低，则会影响鸡群生长发育，引起应激。不及时调节通风小窗，鸡舍的局部鸡笼位置受到的风速会显著大于平均风速，使得鸡群产生应激而容易诱发疫病。因此，在季节交替的时候，鸡舍管理员要及时对鸡舍的通风小窗等设施进行调整，不能仅仅在早晨调整之后一天不变，或仅限于早晚。
JZE01菌株经过药敏试验，耐药率为66.67%，存在多重耐药性。与2013年冯国亮报道的太原及周边地区鸡场94株E.coli 分离株对25种抗菌药物的耐药率和2018年刘华栋报道的山西省鸡源大肠杆菌72株分离菌对12种常见药物的耐药性分析相比，耐药性有不同程度的降低;与周边河南省和山东省报道的部分地区的大肠杆菌耐药性在90%以上相比耐药程度降幅较大[5-8]。这是由于该公司与集团合作技术领先优势和立体笼养模式优于网养等其它养殖模式，立体养殖模式不断提高了肉鸡养殖的福利待遇，也说明国家级龙头企业确实起到了引领和示范的作用。E.coli 的耐药性不可能在短期内完全消失，随着抗生素在我国畜禽饲料中禁用措施的实施，细菌的抗药性将会得到更大的降低。
4 结论
规模化商品肉鸡养殖场中，从肉鸡体内分离的大肠杆菌菌株具有多重耐药性和较强的致病性，季节交替要注意防风保暖，加强饲养管理。
参考文献：
[1] Breed，carolin 伯杰.伯杰式细菌鉴定手册（第9版） [M].美国：中译本科学出版社， 1984.
[2] 牛晋国，申李琰，张希瑶，等.立体养殖肉鸡舍不同源大肠杆菌的分离鉴定与16S rDNA同源性分析[J].中国家禽，2019，41（24）：44-48.
[3] 孙月萍，牟泽华，刘文华.一起商品肉鸡传染性囊病病毒大肠杆菌混合感染的诊治[J].中国兽医杂志，2018，（11）：43-45.
[4] 金海林，王秋霞，杨桂连，等.肉鸡新城疫与大肠杆菌病混合感染的诊治[J].黑龙江畜牧兽医，2017，（20）：154-155.
[5] 冯国亮.鸡致病性大肠杆菌血清型分离、鉴定及消毒液筛选[D].太谷：山西农业大学，2013.
[6] 刘华栋，唐娟，李婷婷，等.山西地区鸡源性大肠杆菌分离株药物敏感性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2018，（5）：132-135.
[7] 冯小旭.河南省部分地区鸡大肠杆菌病流行病学、耐药性及防治研究[D].洛阳：河南科技大学， 2017.
[8] 樊爱丽.山东部分地区肉鸡大肠杆菌病耐药性检测及临床治疗研究[D].长春：吉林大学， 2015.
Abstract：In order to study the resistance and pathogenicity of E.coli in model feeding broilers farms， and to provide evidence for the prevention and treatment of E.coli in large-scale farms.E.coli form collected the samples form dead broilers in the broilers house in Shanxi were isolated，identified，drug sensitive test and pathogenicity analysis.The results showed that a stain pathogenic E.coli with O2 serotype was isolated. The isolated stain has multiple drug resistance to 8 kinds drugs including cephalosporins and quinolones， and highly sensitive to tobramycin and amikacin，and sensitive to doxycycline and ofloxacin. Conclusion： The isolated stain of E.coli from broiler has multiple drug resistance and highly pathogenicity.It is necessary to strengthen the feeding management of chicken farms in the alternate season.
Key words：Broilers;E.coli;Isolation and Identification;drug resistance;pathogenicity analysis
关键词：肉鸡;大肠杆菌;分离鉴定;药敏试验;致病性分析
中图分类号：S858.314.4+3 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2020）5-0045-04
2019年5月山西省晋中市某肉鸡养殖场饲养的30000只33日龄科宝肉鸡出现鸡只死亡增多的现象，病死鸡剖检可见气囊浑浊，心包积液，腹腔内有纤维素样渗出物，肠粘膜充血，偶见出血，盲肠扁桃体出血。初步诊断为大肠杆菌感染，无菌采取病死鸡的肝组织、肺组织样品，冰盒保存，送实验室12h内进行细菌的分离培养鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料 检测样品，为某肉鸡养殖场送检的病死鸡;试验用培养基，购自青岛宾得生物技术有限公司，实验室现配现用;细菌微量生化反应管和药敏试纸，购自杭州滨和微生物试剂有限公司;PCR试剂，购自北京美吉桑格生物医药科技有限公司;大肠杆菌“O”抗原单价血清，中国兽医药品监察所生产。试验动物，1日龄商品代雏鸡20只，山西省太原市北格种鸡场馈赠。
1.2 细菌分离培养 称取0.1g的病死鸡肺组织样品，生理盐水梯度稀释，接种于麦康凯培养基，温箱37℃培养过夜。挑选粉红色单菌落，再次接种于伊红美蓝琼脂，37℃过夜培养。挑选有金属光泽的菌落接种于肉汤，振荡培养后温箱过夜，染色镜检。
1.3 生化鉴定 按照《伯杰氏细菌鉴定手册》[1]，将肉汤培养基中的菌液，分别滴入生化反应管鉴定。
1.4 PCR鉴定 根据大肠杆菌16S rDNA的保守基因片段，设计引物，引物序列与反应体系参照文献方法进行[2]。
1.5 血清型鉴定 采用大肠杆菌单因子标准阳性血清，与分离菌株的菌体抗原进行玻璃板凝集反应。
1.6 药物敏感性试验 采用K-B纸片扩散法进行药物的敏感性试验，参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLC）标准进行操作与判断。
1.7 致病性试验 采用腹腔注射法，将调到3×108CFU/mL的菌液，注射7日龄雏鸡0.5mL/只，设不注射和注射生理盐水的对照组两个，每组6只雏鸡。观察雏鸡死亡情况，并取死亡鸡只病变组织，分离菌株与原菌液菌进行比较。
2 结果
2.1 细菌的分离培养 细菌的分离培养结果见图1。
样品液在麦康凯平板长出光滑、红色的菌落，（图1A），在伊红美蓝琼脂上长出了带有金属光泽的菌落，划线分离出一株菌株，命名为JZE01。将JZE01在营养肉汤里培养后出现浑浊，革兰氏染色镜检为红色的两端钝圆的长杆菌（图1B），符合大肠杆菌形态。
2.2 生化鉴定 JZE01菌株生化反应鉴定结果见表1。
由表1可知，该菌可以发酵糖，吲哚试验、甲基红试验阳性，不产生H2S，初步鉴定JZE01为大肠杆菌。
2.3 PCR鉴定 将JZE01菌株菌液进行16S rDNA基因扩增得到与预期基本一致的片段，约1450bp。回收测序，进行BLAST比对，与大肠杆菌同源性为99.92%。
2.4 血清型鑒定 利用“O”抗原标准血清进行鉴定，JZE01菌定型为O2。
2.5 药敏试验 选取常见的抗菌药物12种，对菌株JZE01进行药物敏感性试验，试验结果显示JZE01株对头孢类、喹诺酮类等8种药物耐药，对妥布霉素、阿米卡星高敏，对强力霉素、氧氟沙星中敏，表明分离株JZE01对多种药物具有耐药性。药敏试验结果见表2。
2.6 致病性试验 腹腔注射菌苗后的雏鸡，6h后出现精神不振、怕冷扎堆、食欲降低甚至废绝，很少饮水，并出现白色稀粪，在21、33、69h检查各死亡2只，剖检病死鸡发现气囊浑浊增厚，心包有积液，包膜增厚，有纤维素性渗出物，肠道出血，有粘性渗出物。对照组生长正常，未出现任何症状。回收死亡鸡组织，分离到与原接种菌一致的菌株。
3 讨论
大肠杆菌是一种条件性致病菌，在规模化肉鸡养殖场的鸡舍中，从舍内环境、裸露饲料、饮水和粪便等来源中均可以分离到该菌，它的血清型复杂，其中的致病性大肠杆菌（avian pathogenic Escherichia coli， APEC）给肉鸡养殖业带来了严重的危害，特别是当肉鸡群发生病毒性疾病或者支原体病时，可以造成肉鸡死淘率增加[2-4]。据调查规模化白羽肉鸡养殖场发生大肠杆菌病的主要原因：一是环境因素突变引起的鸡群应激，当外界气温骤升骤降或者刮起大风，鸡舍没有及时调节通风小窗的大小，造成局部温度高于或者低于设定温度，时间长久导致鸡群抵抗力下降，诱发大肠杆菌病;二是鸡场发生其它疫病的时候，比如发生支原体病或者新城疫时，鸡群免疫功能降低，发生与大肠杆菌病的混合感染或者继发感染;三是饲料和饮水中含有大肠杆菌，规模化的鸡场应该定期对饲料和饮水进行大肠杆菌指标检测，一旦发现指数超标，就要停止使用，在清除原因后再进行饲喂或者饮水;四是粪便中的大肠杆菌引起，鸡的粪便中含有致病性大肠杆菌，可以通过其它途径感染鸡群，这与粪便清理的速度密切相关，要求鸡舍每日清理粪便，特别是在炎热的夏季。 5月正是山西省春夏交替季节，风大干燥、气温变换不定、昼夜温差大。白羽肉鸡养殖到了后期，体型較大，如果不注意及时加大通风量、开启湿帘或者调节通风小窗，就会造成鸡舍短暂性的局部气温忽高忽低。如果鸡舍局部气温升高，会加大鸡只的喘息，使得CO2浓度升高，造成鸡群应激抵抗力下降;温度降低，则会影响鸡群生长发育，引起应激。不及时调节通风小窗，鸡舍的局部鸡笼位置受到的风速会显著大于平均风速，使得鸡群产生应激而容易诱发疫病。因此，在季节交替的时候，鸡舍管理员要及时对鸡舍的通风小窗等设施进行调整，不能仅仅在早晨调整之后一天不变，或仅限于早晚。
JZE01菌株经过药敏试验，耐药率为66.67%，存在多重耐药性。与2013年冯国亮报道的太原及周边地区鸡场94株E.coli 分离株对25种抗菌药物的耐药率和2018年刘华栋报道的山西省鸡源大肠杆菌72株分离菌对12种常见药物的耐药性分析相比，耐药性有不同程度的降低;与周边河南省和山东省报道的部分地区的大肠杆菌耐药性在90%以上相比耐药程度降幅较大[5-8]。这是由于该公司与集团合作技术领先优势和立体笼养模式优于网养等其它养殖模式，立体养殖模式不断提高了肉鸡养殖的福利待遇，也说明国家级龙头企业确实起到了引领和示范的作用。E.coli 的耐药性不可能在短期内完全消失，随着抗生素在我国畜禽饲料中禁用措施的实施，细菌的抗药性将会得到更大的降低。
4 结论
规模化商品肉鸡养殖场中，从肉鸡体内分离的大肠杆菌菌株具有多重耐药性和较强的致病性，季节交替要注意防风保暖，加强饲养管理。
参考文献：
[1] Breed，carolin 伯杰.伯杰式细菌鉴定手册（第9版） [M].美国：中译本科学出版社， 1984.
[2] 牛晋国，申李琰，张希瑶，等.立体养殖肉鸡舍不同源大肠杆菌的分离鉴定与16S rDNA同源性分析[J].中国家禽，2019，41（24）：44-48.
[3] 孙月萍，牟泽华，刘文华.一起商品肉鸡传染性囊病病毒大肠杆菌混合感染的诊治[J].中国兽医杂志，2018，（11）：43-45.
[4] 金海林，王秋霞，杨桂连，等.肉鸡新城疫与大肠杆菌病混合感染的诊治[J].黑龙江畜牧兽医，2017，（20）：154-155.
[5] 冯国亮.鸡致病性大肠杆菌血清型分离、鉴定及消毒液筛选[D].太谷：山西农业大学，2013.
[6] 刘华栋，唐娟，李婷婷，等.山西地区鸡源性大肠杆菌分离株药物敏感性分析[J].黑龙江畜牧兽医，2018，（5）：132-135.
[7] 冯小旭.河南省部分地区鸡大肠杆菌病流行病学、耐药性及防治研究[D].洛阳：河南科技大学， 2017.
[8] 樊爱丽.山东部分地区肉鸡大肠杆菌病耐药性检测及临床治疗研究[D].长春：吉林大学， 2015.
Abstract：In order to study the resistance and pathogenicity of E.coli in model feeding broilers farms， and to provide evidence for the prevention and treatment of E.coli in large-scale farms.E.coli form collected the samples form dead broilers in the broilers house in Shanxi were isolated，identified，drug sensitive test and pathogenicity analysis.The results showed that a stain pathogenic E.coli with O2 serotype was isolated. The isolated stain has multiple drug resistance to 8 kinds drugs including cephalosporins and quinolones， and highly sensitive to tobramycin and amikacin，and sensitive to doxycycline and ofloxacin. Conclusion： The isolated stain of E.coli from broiler has multiple drug resistance and highly pathogenicity.It is necessary to strengthen the feeding management of chicken farms in the alternate season.
Key words：Broilers;E.coli;Isolation and Identification;drug resistance;pathogenicity analysis