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摘 要：由于水蜜桃采后极易腐烂变质，延长其贮藏期成为当前的研究热点。鉴于使用化学保鲜剂对环境和人体存在危害，观测和比较了3种病原菌拮抗菌——罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii），季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）和丝孢酵母（Trichosporon aquatile）对白花水蜜桃（Prunus persica）采后保鲜品质的影响。试验采取直接喷果的方式，果实处理后装入保鲜袋置于常温条件下（28～30 ℃），24 h后测量其生理指标。结果表明：罗伦隐球酵母保鲜效果最优，季也蒙假丝酵母保鲜效果其次，均好于丝孢酵母保鲜效果。由于这3种酵母菌作为工程菌容易获得，相对安全，因此，对凤凰水蜜桃而言，拮抗菌制剂作为相对有效且无污染的生物保鲜剂，适宜推广应用。
关键词：凤凰白花水蜜桃；罗伦隐球酵母；季也蒙假丝酵母；丝孢酵母；生物保鲜剂
中图分类号：S662.2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.012
水蜜桃以肉质细腻，皮薄多汁，营养丰富深受人们喜爱。‘白花’水蜜桃属于软溶质型桃，收获季节多处于梅雨季节，气温高湿度大，采摘贮运中容易受机械损伤腐烂变质[1]。因此，研究水蜜桃的贮藏保鲜很有必要，关于这方面的研究已有不少报道，主要的保鲜方法有冷藏保鲜[2]、涂膜保鲜[3]、真空处理[4]。而微生物保鲜方法作为生物方法中的翘楚，其效果尤为显著[5]，它主要是利用微生物间的拮抗作用抑制病原菌生长[6]。酵母菌的主要优点是可以在干燥的果树表面生存，利用营养迅速繁殖[7-8]，不产生毒素，受杀菌剂影响小[9]，且具有广谱抗性和较为稳定的防治效果[10]。
罗伦隐球酵母 （Cryptococcus laurentii）已被用于控制苹果、梨的青霉病和灰霉病病害，以及草莓、猕猴桃和西柚等水果病害的生物防治中[11]；范青等人研究发现，从桃果实表面分离得到的丝孢酵母（Trichosporon aquatile）能防治苹果灰霉病和青霉病[12]， Roberts[13]认为，丝孢酵母（Trichosporon aquatile）可以在苹果伤口繁殖，抑制黑斑病和坏死病，其悬浮液在25 ℃可抑制苹果灰霉病和青霉病。Roberts[11]认为，由于季也蒙假丝酵母可以利用低浓度营养，同病原菌在伤口处进行营养竞争，可有效抑制油桃和桃果实的采后软腐病[3]。
本研究在总结近3年试验数据的基础上，对比不同浓度的3种拮抗菌液对‘白花’水蜜桃的保鲜效果，研究3种菌液在室温（28～30 ℃）条件下，菌液的最优浓度对水蜜桃呼吸强度、失重率、腐烂指数、硬度、可溶性固形物含量、相对电导率、丙二醛含量、PPO酶活性等8种生理指标的影响，选取优势拮抗菌。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 拮抗菌 从中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）购得丝孢酵母（Trichosporon aquatile），季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）。
1.1.2 水蜜桃 试验用采于张家港凤凰镇的‘白花’水蜜桃，色泽相近、大小相似、无损伤无虫害，编号后冷藏待用。
1.2 主要仪器
无菌操作台、水浴锅、恒温震荡培养箱、电子天平、恒温冷藏冰箱、血球计数板、DDS-11A型电导率仪、VBR-18型手持折光仪、接种环、GY-3型水果硬度仪、显微镜、756MC型紫外-可见分光光度计、TGL1650-WS台式高速离心机、保鲜袋等。
1.3 试验方法
1.3.1 菌悬液配置 将3种酵母菌活化后，接种于NYDA（葡萄糖10 g，琼脂15 g，营养肉汤8 g，酵母浸膏5 g，水1 000 mL）培养基，28 ℃培养48 h，再取两环于50 mL NYDB（不加琼脂的NYDA）的三角瓶中，28 ℃恒温振荡培养（150 r·min-1）48 h后，制备成以下3种处理液：A）5×108 CFU·mL-1 丝孢酵母培养液；B） 5×108 CFU·mL-1季也蒙假丝酵母培养液；C） 5×108 CFU·mL-1罗伦隐球酵母培养液。并设置对照组：CK）无菌水。
1.3.2 试验分组及处理 6个果实一组，均匀喷洒3种拮抗菌液和对照无菌水，通风晾干、套袋，室温中保存，24 h后，每天测量各组果实的各生理指标，每组测量3个重复，整个试验重复2次。
1.3.3 测量指标和方法 称重法测定失水率[14]。公式为：腐烂指数=[Σ（级数×对应腐烂果数量）]/该组果实总数[15]，计算腐烂指数。
GY-3硬度仪测定果实硬度[15]。
手持折光仪测定可溶性糖含量[15]。
静置法测定呼吸强度[16]。公式为：相对电导率=（初始电导率-纯水电导率）/（煮沸后的电导率-纯水电导率）×100%。采用DDS-11A型电导率仪测定相对电导率[14]。
硫代巴比妥（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量[16]。
邻苯二酚法测定多酚氧化酶（PPO）[17]。
1.4 数据及图表处理
用Excel 2007对本试验数据进行运算后绘制成图表；用SPSS 17.0进行One-way ANOVA ，然后进行邓肯氏多重差异分析。
2 结果与讨论
2.1 不同菌液对水蜜桃失重率的影响
各组失重率变化如图1所示，第4天对照组失重率为1.49%，而拮抗菌处理组果实失重率分别为：A组，0.81%；B组，1.13%；C组，0.69%。3种菌液可以抑制果实的失重率，效果最好的是C处理组，其次为B处理组、A处理组，但这3组均好于对照组。 2.2 不同菌液对水蜜桃腐烂指数的影响
各组水蜜桃的腐烂指数变化如图2所示，3种拮抗菌处理后，腐烂指数均明显低于对照组，前4天基本上无腐烂现象，腐烂现象在第5天出现，表明3种拮抗菌均能有效控制果实腐烂，效果最好的是B组，其次是A组、C组。
2.3 不同菌液对水蜜桃硬度的影响
各组硬度的变化如图3所示，第4天，各处理组的硬度值分别为：A组，4.33 kg·cm-2；B组，3.48 kg·cm-2；C组，3.52 kg·cm-2，均好于对照组。拮抗菌液可以维持水蜜桃硬度，缓解水蜜桃软化。B组好于A组好于C组。
2.4 不同菌液对水蜜桃可溶性固形物含量的影响
各组可溶性固形物含量的变化如图4所示，第3天拮抗菌处理组的可溶性固形物含量分别为11.78，11.57，11.56 mmol·L-1，对照组为11.80 mmol·L-1。数据表明，B组、C组对可溶性固形物起到促进作用；对照组和A组均为抑制作用。
2.5 不同菌液对水蜜桃呼吸强度的影响
各组呼吸强度变化如图5所示，对照组水蜜桃在第3天出现呼吸高峰74.85 mL·（kg·h）-1，随后呼吸强度下降，A和B两种处理使水蜜桃的呼吸高峰被推迟到第4天，呼吸作用也相对减弱，而C组未起到推迟呼吸高峰的作用。3组呼吸高峰分别为：A组，68.20 mL·kg-1·h-1；B组，58.20 mL·kg-1·h-1；C组，70.15 mL·kg-1·h-1，C组和B组推迟并减缓了水蜜桃的呼吸作用，A组只起到相对减缓水蜜桃呼吸作用的效果。
2.6 不同菌液对水蜜桃相对电导率的影响
各组相对电导率变化率如图6所示，B组和C组的相对电导率较低，说明B、C组在保护细胞膜方面的效果较优；A组的相对电导率较高，说明其不能很好地抑制果实细胞膜受损。
2.7 不同菌液对水蜜桃丙二醛含量的影响
各组丙二醛（MDA）变化如图7所示，B组和C组对水蜜桃有明显抑制效果，A组效果其次，表明罗伦隐球酵母和季也蒙假丝酵母在一定程度上减小了膜脂过氧化程度。
2.8 不同菌液对水蜜桃PPO酶活性的影响
各组多酚氧化酶（PPO）活性变化如图8所示，PPO酶活性随贮藏时间的延长逐渐下降，下降趋势先快后慢。第4 天，各组PPO酶活为：对照组为405.33 U·g-1，A组为405 U·g-1，B组为416 U·g-1，C组为309 U·g-1。数据表明：拮抗菌可以抑制水蜜桃的PPO酶活性，C组与B组效果较好，A组其次。
通过在桃果实表面喷洒拮抗菌，使之与病原菌进行营养竞争，从而对水蜜桃进行保鲜。试验证实经拮抗菌处理后，水蜜桃的腐烂指数有所下降，呼吸强度得到一定程度的减缓，抑制了酶活性以及细胞膜透性。在常温条件（28～30 ℃）下，可贮藏6 d左右。
就保鲜效果而言，季也蒙假丝酵母菌液在维持水蜜桃硬度、减缓腐烂程度、降低丙二醛含量、维持细胞膜稳定性方面优势显著；罗伦隐球酵母菌液在维持水蜜桃质量，抑制水蜜桃呼吸和降低PPO酶活性方面效果优于季也蒙假丝酵母和丝孢酵母；丝孢酵母与其他两组拮抗菌相比，保鲜效果不明显，但依然好于对照组，因此，其作为拮抗菌虽有一定的保鲜效果，但效果并不显著。
3 结 论
酵母菌可以利用营养竞争在较干燥的果蔬表面生存，由于不产生抑菌物质、受杀菌剂影响小，被广泛应用于食品工业中。利用酵母菌作为一种拮抗菌，应对由真菌属病原体引起的水蜜桃腐烂，具有良好的效果。
本试验所采用的罗伦隐球酵母、季也蒙假丝酵母、丝孢酵母均购置于中国微生物菌种保藏中心，在培养期间所有操作在无菌操作台中进行，配置培养基所用试剂为食品级，可以保证其安全性。
季也蒙假丝酵母处理组对‘白花’水蜜桃的保鲜效果较好，在维持水蜜桃硬度、降低丙二醛含量、抑制细胞膜受损、推迟呼吸高峰等方面优势显著，相对其他两组而言为较优处理组；而罗伦隐球酵母在维持果实的失重率、减缓腐烂程度、降低其PPO酶活性等方面优势显著；丝孢酵母处理组与这两种拮抗菌相比，保鲜效果不明显，但比对照组的保鲜效果好。对凤凰‘白花’水蜜桃而言，酵母菌液作为一种有效且无污染的生物保鲜剂，适宜推广应用。
总之，罗伦隐球酵母菌液、季也蒙假丝酵母菌液和丝孢酵母菌液处理是经济、有效、可操作性强的方法，适合在广大果农中推广使用，具有广阔的应用前景和推广价值。
参考文献：
[1] 周然，谢晶.水蜜桃低温保鲜技术研究进展[J].山西农业科学，2011，39（6）：622-623.
[2] 段振华.水蜜桃保鲜技术研究进展[J].食品研究与开发，2002，23（2）：5-7.
[3] 陈奕兆，孙政国，李建龙.水蜜桃涂膜保鲜技术开发利用的研究进展[J].保鲜与加工，2010，10（5）：48-50
[4] 李文香，张慜，余汉清.不同真空处理对水蜜桃贮藏效果的研究[J].食品与生物技术学报，2006，25（3）：58-62.
[5]巩文峰，马青.3株拮抗酵母菌对苹果采后青霉病的防治效果[J].西北农林科技大学学报，2007，35（12）：191-194.
[6] 李红叶.果蔬采后病害生物防治研究进展[J].生物防治通报，1993，9（4）：176-180.
[7] Maclaughlin R J，Wilson C L，Droby S， et al. Biological control of postharvest diseases of grape，peach and apple with yeasts Kloeckera apiculata and Candida guilliermondii[J].Plant Disease，1992，76：470-473. [8] Wisniewski M E， Wilson C L. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables： Recent advances [J].Hort Science， 1992， 27：94-98.
[9] 刘海波，田世平，秦国政，等.罗伦隐球酵母对葡萄采后病害的拮抗效果[J].中国农业科学，2002，35（7）：83l-835.
[10] 张建，毛晓英.酵母拮抗菌与碳酸氢钠配合对蟠桃果实采后腐烂及品质的影响[J].江苏农业科学，2009（3）：297-299.
[11] 范青，田世平，姜爱丽，等.采摘后果实病害生物防治拮抗菌的筛选和分离[J].中国环境科学，2001， 21（4）：313-316.
[12] 范青，田世平，徐勇，等.季也蒙假丝酵母对采后桃果实软腐病的抑制效果[J].植物学学报，2000，42（10）：1 033-1 038.
[13] Roberts R G. Postharvest biological control of gray mold of apple by Cryptococcus laurentii[J].Phytopathology， 1990， 80： 526-530.
[14] Maclaughlin R J， Wilson C L， Droby S， et al. Biological control of postharvest diseases of grape， peach and apple with yeasts Kloeckera apiculata and Candida guilliermondii[J]. Plant Disease， 1992， 76： 470-473.
[15] 杨增军，张华云.果蔬贮藏学试验指导[M].莱阳：莱阳农学院，1995： 1-46.
[16] 张志良，瞿伟菁.植物生理学试验指导[M].北京：高等教育出版社，2003： 274-277.
[17] 刘海波，田世平，秦国政， 等. 罗伦隐球酵母对葡萄采后病害的拮抗效果[J].中国农业科学， 2002， 35（7）： 83l-835.
关键词：凤凰白花水蜜桃；罗伦隐球酵母；季也蒙假丝酵母；丝孢酵母；生物保鲜剂
中图分类号：S662.2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.012
水蜜桃以肉质细腻，皮薄多汁，营养丰富深受人们喜爱。‘白花’水蜜桃属于软溶质型桃，收获季节多处于梅雨季节，气温高湿度大，采摘贮运中容易受机械损伤腐烂变质[1]。因此，研究水蜜桃的贮藏保鲜很有必要，关于这方面的研究已有不少报道，主要的保鲜方法有冷藏保鲜[2]、涂膜保鲜[3]、真空处理[4]。而微生物保鲜方法作为生物方法中的翘楚，其效果尤为显著[5]，它主要是利用微生物间的拮抗作用抑制病原菌生长[6]。酵母菌的主要优点是可以在干燥的果树表面生存，利用营养迅速繁殖[7-8]，不产生毒素，受杀菌剂影响小[9]，且具有广谱抗性和较为稳定的防治效果[10]。
罗伦隐球酵母 （Cryptococcus laurentii）已被用于控制苹果、梨的青霉病和灰霉病病害，以及草莓、猕猴桃和西柚等水果病害的生物防治中[11]；范青等人研究发现，从桃果实表面分离得到的丝孢酵母（Trichosporon aquatile）能防治苹果灰霉病和青霉病[12]， Roberts[13]认为，丝孢酵母（Trichosporon aquatile）可以在苹果伤口繁殖，抑制黑斑病和坏死病，其悬浮液在25 ℃可抑制苹果灰霉病和青霉病。Roberts[11]认为，由于季也蒙假丝酵母可以利用低浓度营养，同病原菌在伤口处进行营养竞争，可有效抑制油桃和桃果实的采后软腐病[3]。
本研究在总结近3年试验数据的基础上，对比不同浓度的3种拮抗菌液对‘白花’水蜜桃的保鲜效果，研究3种菌液在室温（28～30 ℃）条件下，菌液的最优浓度对水蜜桃呼吸强度、失重率、腐烂指数、硬度、可溶性固形物含量、相对电导率、丙二醛含量、PPO酶活性等8种生理指标的影响，选取优势拮抗菌。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 拮抗菌 从中国农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）购得丝孢酵母（Trichosporon aquatile），季也蒙假丝酵母（Candida guilliermondii）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）。
1.1.2 水蜜桃 试验用采于张家港凤凰镇的‘白花’水蜜桃，色泽相近、大小相似、无损伤无虫害，编号后冷藏待用。
1.2 主要仪器
无菌操作台、水浴锅、恒温震荡培养箱、电子天平、恒温冷藏冰箱、血球计数板、DDS-11A型电导率仪、VBR-18型手持折光仪、接种环、GY-3型水果硬度仪、显微镜、756MC型紫外-可见分光光度计、TGL1650-WS台式高速离心机、保鲜袋等。
1.3 试验方法
1.3.1 菌悬液配置 将3种酵母菌活化后，接种于NYDA（葡萄糖10 g，琼脂15 g，营养肉汤8 g，酵母浸膏5 g，水1 000 mL）培养基，28 ℃培养48 h，再取两环于50 mL NYDB（不加琼脂的NYDA）的三角瓶中，28 ℃恒温振荡培养（150 r·min-1）48 h后，制备成以下3种处理液：A）5×108 CFU·mL-1 丝孢酵母培养液；B） 5×108 CFU·mL-1季也蒙假丝酵母培养液；C） 5×108 CFU·mL-1罗伦隐球酵母培养液。并设置对照组：CK）无菌水。
1.3.2 试验分组及处理 6个果实一组，均匀喷洒3种拮抗菌液和对照无菌水，通风晾干、套袋，室温中保存，24 h后，每天测量各组果实的各生理指标，每组测量3个重复，整个试验重复2次。
1.3.3 测量指标和方法 称重法测定失水率[14]。公式为：腐烂指数=[Σ（级数×对应腐烂果数量）]/该组果实总数[15]，计算腐烂指数。
GY-3硬度仪测定果实硬度[15]。
手持折光仪测定可溶性糖含量[15]。
静置法测定呼吸强度[16]。公式为：相对电导率=（初始电导率-纯水电导率）/（煮沸后的电导率-纯水电导率）×100%。采用DDS-11A型电导率仪测定相对电导率[14]。
硫代巴比妥（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量[16]。
邻苯二酚法测定多酚氧化酶（PPO）[17]。
1.4 数据及图表处理
用Excel 2007对本试验数据进行运算后绘制成图表；用SPSS 17.0进行One-way ANOVA ，然后进行邓肯氏多重差异分析。
2 结果与讨论
2.1 不同菌液对水蜜桃失重率的影响
各组失重率变化如图1所示，第4天对照组失重率为1.49%，而拮抗菌处理组果实失重率分别为：A组，0.81%；B组，1.13%；C组，0.69%。3种菌液可以抑制果实的失重率，效果最好的是C处理组，其次为B处理组、A处理组，但这3组均好于对照组。 2.2 不同菌液对水蜜桃腐烂指数的影响
各组水蜜桃的腐烂指数变化如图2所示，3种拮抗菌处理后，腐烂指数均明显低于对照组，前4天基本上无腐烂现象，腐烂现象在第5天出现，表明3种拮抗菌均能有效控制果实腐烂，效果最好的是B组，其次是A组、C组。
2.3 不同菌液对水蜜桃硬度的影响
各组硬度的变化如图3所示，第4天，各处理组的硬度值分别为：A组，4.33 kg·cm-2；B组，3.48 kg·cm-2；C组，3.52 kg·cm-2，均好于对照组。拮抗菌液可以维持水蜜桃硬度，缓解水蜜桃软化。B组好于A组好于C组。
2.4 不同菌液对水蜜桃可溶性固形物含量的影响
各组可溶性固形物含量的变化如图4所示，第3天拮抗菌处理组的可溶性固形物含量分别为11.78，11.57，11.56 mmol·L-1，对照组为11.80 mmol·L-1。数据表明，B组、C组对可溶性固形物起到促进作用；对照组和A组均为抑制作用。
2.5 不同菌液对水蜜桃呼吸强度的影响
各组呼吸强度变化如图5所示，对照组水蜜桃在第3天出现呼吸高峰74.85 mL·（kg·h）-1，随后呼吸强度下降，A和B两种处理使水蜜桃的呼吸高峰被推迟到第4天，呼吸作用也相对减弱，而C组未起到推迟呼吸高峰的作用。3组呼吸高峰分别为：A组，68.20 mL·kg-1·h-1；B组，58.20 mL·kg-1·h-1；C组，70.15 mL·kg-1·h-1，C组和B组推迟并减缓了水蜜桃的呼吸作用，A组只起到相对减缓水蜜桃呼吸作用的效果。
2.6 不同菌液对水蜜桃相对电导率的影响
各组相对电导率变化率如图6所示，B组和C组的相对电导率较低，说明B、C组在保护细胞膜方面的效果较优；A组的相对电导率较高，说明其不能很好地抑制果实细胞膜受损。
2.7 不同菌液对水蜜桃丙二醛含量的影响
各组丙二醛（MDA）变化如图7所示，B组和C组对水蜜桃有明显抑制效果，A组效果其次，表明罗伦隐球酵母和季也蒙假丝酵母在一定程度上减小了膜脂过氧化程度。
2.8 不同菌液对水蜜桃PPO酶活性的影响
各组多酚氧化酶（PPO）活性变化如图8所示，PPO酶活性随贮藏时间的延长逐渐下降，下降趋势先快后慢。第4 天，各组PPO酶活为：对照组为405.33 U·g-1，A组为405 U·g-1，B组为416 U·g-1，C组为309 U·g-1。数据表明：拮抗菌可以抑制水蜜桃的PPO酶活性，C组与B组效果较好，A组其次。
通过在桃果实表面喷洒拮抗菌，使之与病原菌进行营养竞争，从而对水蜜桃进行保鲜。试验证实经拮抗菌处理后，水蜜桃的腐烂指数有所下降，呼吸强度得到一定程度的减缓，抑制了酶活性以及细胞膜透性。在常温条件（28～30 ℃）下，可贮藏6 d左右。
就保鲜效果而言，季也蒙假丝酵母菌液在维持水蜜桃硬度、减缓腐烂程度、降低丙二醛含量、维持细胞膜稳定性方面优势显著；罗伦隐球酵母菌液在维持水蜜桃质量，抑制水蜜桃呼吸和降低PPO酶活性方面效果优于季也蒙假丝酵母和丝孢酵母；丝孢酵母与其他两组拮抗菌相比，保鲜效果不明显，但依然好于对照组，因此，其作为拮抗菌虽有一定的保鲜效果，但效果并不显著。
3 结 论
酵母菌可以利用营养竞争在较干燥的果蔬表面生存，由于不产生抑菌物质、受杀菌剂影响小，被广泛应用于食品工业中。利用酵母菌作为一种拮抗菌，应对由真菌属病原体引起的水蜜桃腐烂，具有良好的效果。
本试验所采用的罗伦隐球酵母、季也蒙假丝酵母、丝孢酵母均购置于中国微生物菌种保藏中心，在培养期间所有操作在无菌操作台中进行，配置培养基所用试剂为食品级，可以保证其安全性。
季也蒙假丝酵母处理组对‘白花’水蜜桃的保鲜效果较好，在维持水蜜桃硬度、降低丙二醛含量、抑制细胞膜受损、推迟呼吸高峰等方面优势显著，相对其他两组而言为较优处理组；而罗伦隐球酵母在维持果实的失重率、减缓腐烂程度、降低其PPO酶活性等方面优势显著；丝孢酵母处理组与这两种拮抗菌相比，保鲜效果不明显，但比对照组的保鲜效果好。对凤凰‘白花’水蜜桃而言，酵母菌液作为一种有效且无污染的生物保鲜剂，适宜推广应用。
总之，罗伦隐球酵母菌液、季也蒙假丝酵母菌液和丝孢酵母菌液处理是经济、有效、可操作性强的方法，适合在广大果农中推广使用，具有广阔的应用前景和推广价值。
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