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摘 要 采用80 ℃水浴处理与稀释涂布法从莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中分离获得215株芽胞杆菌。采用16S rDNA PCR-RFLP与16S rDNA序列分析技术，对分离的菌株进行遗传多样性分析。16S rDNA PCR-RFLP酶切图谱UPGMA聚类分析结果表明，在100%的相似性水平上，分离菌株归属到9种酶切类型。16S rDNA测序结果显示，这些菌株主要分布在Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等4个属，其中Pontibacillus为优势属。有7株芽胞杆菌的16S rDNA序列与数据库中相应模式菌的最大相似性在97.4%～99.0%之间，有可能为芽胞杆菌新种资源。
关键词 芽胞杆菌；多样性；16S rDNA PCR-RFLP；系统发育分析
中图分类号 S476.1 文献标识码 A
Abstract 215 Bacillus-like bacterial strains were obtained from Yinggehai Saltern sediment of 30% salinity salt pond by using the method of 80 ℃ water bath treatment and diluting spread. The genetic diversities were analyzed by 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rRNA gene sequence analysis. In the similarity level of 100%， cluster analysis of UPGMA map and 16S rDNA PCR-RFLP macrorestriction map showed that the isolates were grouped into 9 clusters， including genus Pontibacillus， Halobacillus， Oceanobacillus and Bacillus， in which Pontibacillus was the dominant one. Based on the comparison of 16S rRNA gene sequences， the highest similarities of seven strains with the corresponding type strains ranged from 97.4% to 99.0%. The results showed that culturable Bacillus-like species from Yinggehai Saltern sediment revealed high genetic diversity and there existed some novel species.
Key words Bacillus-like species； Diversity； 16S rDNA PCR-RFLP； Phylogeny analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.028
芽胞杆菌为土壤细菌中的常见类群，是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色多为阳性、能产生芽胞的化能异养型细菌，广泛分布于各种生态环境中，如水体[1]、土壤[2]、深海沉积物[3]。芽胞杆菌种类繁多、数量巨大、能够产生多种生理活性物质和代谢产物。芽胞杆菌在工农业、医药卫生、环保等领域具有广泛的用途，如防治植物病虫害[4]、处理工业废水[5]等。
莺歌海盐场位于海南省乐东县西南部海滨，是中国南方最大的海盐厂，海滩涂地带盐田总面积37.97 km2，占全岛盐田总面积的63%，属人工形成的海洋高盐环境。高盐环境中存在着独特的微生物区系，过去对陆地高盐环境中微生物的研究较多[6-11]，且发现芽胞杆菌属为优势菌群。莺歌海盐场由一系列的晒盐池组成，本研究对莺歌海盐场卤水盐度为30%晒盐池底泥中的可培养芽胞杆菌资源进行分离培养及遗传多样性研究，为了解、利用极端环境中的芽孢杆菌资源奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 底泥样品采集于莺歌海盐场卤水盐度为30%的晒盐池。采用5点采样法采集5～25 cm深的底泥50 g左右，放入无菌采样袋中混合均匀，冰盒储存，及时带回实验室进行菌株分离，剩余样品置4 ℃冰箱中保存备用。
1.1.2 培养基 R2A培养基：1 000 mL中含有可溶性淀粉10 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，酸水解酪素0.5 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸钠0.3 g。PBMY培养基：1 000 mL中含有蛋白胨10 g，酵母膏3 g，牛肉膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。改良营养琼脂培养基：1 000 mL中含有牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g。淡薄培养基：1 000 mL中含有酵母膏0.7 g，蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，（NH4）2SO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1 g。所有培养基盐浓度15%，采用30%的卤水稀释配制，pH7.0，琼脂粉20～25 g/L。
1.2 方法
1.2.1 芽胞杆菌的分离纯化 称取10 g底泥样品，放入盛有90 mL无菌卤水的三角瓶中，置恒温摇床中振荡30 min（30 ℃、200 r/min）；将得到的悬液稀释至10-1～10-6梯度，80 ℃水浴处理20 min以灭活非芽胞细菌；吸取热处理后的悬液0.1 mL，涂布平板，于30 ℃培养箱中倒置培养，观察菌落形状、颜色等表型特征，挑单菌落划线纯化，直至得到纯培养。 1.2.2 芽胞杆菌16S rDNA PCR-RFLP多样性分析
基因组DNA的提取参照相关文献[12]进行。选用以下引物（由上海生工生物技术有限公司合成）扩增16S rDNA基因：P1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT
CAGAACGAACGCT-3′），P6（5′-TACGGCTACCTTG
TTACGACTTCACCCC-3′）。PCR反应程序为： 95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经MspⅠ（TaKaRa）酶切后，用3%琼脂糖凝胶电泳检测。用NTSYS-pc2.01软件进行相似性分析，采用平均连锁法（UPGMA）聚类，得出菌株间的聚类关系[13]。
1.2.3 16S rDNA序列测定及其系统发育分析
从16S rDNA PCR-RFLP分型的不同遗传类型中，各选取1～2株菌进行16S rDNA测序（由上海生工生物工程有限公司完成）。将测序结果在EzTaxon server 2.1和GenBank 中进行BLAST比较分析。采用MEGA5.0以邻位相连法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 芽胞杆菌的分离
采用80 ℃水浴处理与稀释涂布相结合的方法，从4种培养基上共分离获得芽胞杆菌215株。分离于R2A培养基的72株，占分离总数的33.5%；分离于PBMY培养基的61株，占28.4%；分离于改良营养琼脂培养基的48株，占22.3%；分离于淡薄培养基的34株，占15.8%。在R2A培养基上生长的菌落，形态种类较多，而淡薄培养基上的菌落形态较少。
2.2 莺歌海盐场晒盐池底泥芽胞杆菌遗传多样性
从莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中分离的215株芽胞杆菌，经16S rDNA PCR-RFLP初步分型，每1个限制性片断长度多态性类型代表1种酶切类型，共得到9种酶切类型，从9种类型中选出18株代表菌株的酶切图谱见图1。由代表菌株的聚类树状图（图2）可知，相似系数为0.62时，芽胞杆菌分为2个类群；相似系数为0.81时，分为7个类群；相似系数增大至1.00时，芽胞杆菌可分为9个类群。
2.3 菌株16S rDNA序列测定及其系统发育分析
根据每个遗传型包含的菌株数量及其菌落形态特征，从9种酶切类型中选取15株代表菌进行16S rRNA基因序列的测定。将所得序列在EzTaxon server 2.1和GenBank中进行Blast比对分析。结果显示，莺歌海盐场晒盐池底泥可培养芽胞杆菌资源主要分布在芽胞杆菌科（Bacillaceae）和类芽胞杆菌科（Paenibacillaceae）。其中，Bacillaceae科下包含喜盐芽胞杆菌属（Halobacillus，33.3%）、芽胞杆菌属（Bacillus，占13.3%）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus，6.7%）3个属；Paenibacillaceae科下有Pontibacillus属（占46.7%），为可培养芽孢杆菌的优势属，Halobacillus为次优势属。
通过序列比对还发现，16S rDNA最大同源性在99.3%以上的有8株；同源性在98%～99%的有4株，分别是HB12542（98.0%）、HB12541（98.0%）、HB12547（98.1%）和HB12543（98.9%）；同源性在98%以下的有3株，分别是HB12536（97.7%）、HB12548（97.4%）和HB12569（97.8%）。这6株菌有可能代表着芽胞杆菌的新资源，为潜在的新分类单元。
各菌株间的系统进化关系见图3所示。菌株HB12527与菌株HB12530属于Pontibacillus属，在系统发育树上聚为一簇，亲缘关系较近；菌株HB12535与Pontibacillus yanchengensis聚于一簇，参考其16S rDNA的最大同源性数值（99.7%），推测HB12535可能为Pontibacillus yanchengensis；而HB12536、HB12542、HB12547和HB12569聚于系统发育树上Pontibacillus属的另一簇，同时其16S rDNA最大同源性为97.7%～98.1%，这4株菌可能代表着Pontibacillus属新的分类单元。菌株HB12541与Halobacillus naozhouensis的序列相似性最高（98.0%），但在系统发育树中处于一个相对独立的分支，也可能是潜在的新种，有待于进一步进行多相分类以确定其最终归属地位。
3 讨论与结论
高盐环境微生物具有独特的种群类型，它们具有特殊的生理机制及代谢产物类型，是一类极具开发潜力的生物资源。本文对莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中可培养芽胞杆菌资源进行研究，从中分离到215株芽胞杆菌，序列分析结果表明，这些菌株分属于Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus属，存在较高的多样性；此外，系统发育分析表明，莺歌海高盐环境不同种芽胞杆菌间的进化距离比较接近。
海洋（或沿海）高盐环境中的微生物区系不同于内陆高盐环境[14]。肖炜[6]在研究昆明盐矿古老岩盐沉积中可培养细菌多样性时发现，Bacillus为卤水和盐晶中的优势菌，各占总细菌分离量的26.1%和59.9%。冯二梅等[15]对烟台海域中度嗜盐菌进行了分离鉴定，结果表明这些菌分布于7个属，其中芽胞杆菌有Bacillus、Virgibacillus、Gracilibacillus。在陆地高盐环境的研究中，郑贺云等[7]在研究新疆阿克苏地区盐碱地中细菌多样性时得出，Bacillus为其中的主要类群。潘媛媛等[8]在松嫩平原盐碱地中也发现了Bacillus和Oceanobacillus资源。对新疆不同地区高盐环境中嗜盐菌的研究结果表明，不同高盐地区的嗜盐菌在组成上具有一定的相似性：Bacillus和Halobacillus在这些地区均有分布，但在各地区的优势度不同[9-11]。本研究在莺歌海30%盐度晒盐池底泥中也发现了Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等嗜盐芽胞杆菌资源，反映出不同高盐环境芽胞杆菌资源在群落组成上具有一定的相似性。但是，本研究中Pontibacillus为优势属，与陆地高盐环境中的不同，这也证明了海洋高盐环境中芽胞杆菌资源的独特性。 本研究还发现了一些潜在的芽孢杆菌新种，莺歌海高盐环境晒盐池底泥中分离的嗜盐菌HB12536与模式菌种Pontibacillus yanchengensis的亲缘关系最近（相似性为97.7%），是Pontibacillus属的潜在新种。Pontibacillus yanchengensis是一株革兰氏阳性、严格好氧的中度嗜盐芽胞杆菌[16]。菌株HB12541与模式菌种Halobacillus naozhouensis的亲缘关系最近（相似性为98.0%），而Halobacillus naozhouensis是一株革兰氏阳性、具有过氧化氢酶活性、好氧的杆状中度嗜盐细菌[17]。中度嗜盐细菌对环境的适应能力极强，分布广泛，能分泌耐高温的胞外酶（淀粉酶、脂肪酶等）和多聚体，可应用于食品工业、酶制剂和化妆品生产、石油回收、基因工程领域以及环境污染的生物修复领域有着广泛的应用前景[18]。由此可见，莺歌海高盐环境晒盐池底泥中存在着较为丰富的芽孢杆菌资源，并且存在一些潜在的芽孢杆菌新种，有待进一步研究开发。
参考文献
[1] 宁 华， 张荣先， 陈 浩， 等. 滇池中芽孢杆菌的ARDRA分类及溶藻特性[J]. 湖泊科学， 2008， 20（5）： 675-680.
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关键词 芽胞杆菌；多样性；16S rDNA PCR-RFLP；系统发育分析
中图分类号 S476.1 文献标识码 A
Abstract 215 Bacillus-like bacterial strains were obtained from Yinggehai Saltern sediment of 30% salinity salt pond by using the method of 80 ℃ water bath treatment and diluting spread. The genetic diversities were analyzed by 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rRNA gene sequence analysis. In the similarity level of 100%， cluster analysis of UPGMA map and 16S rDNA PCR-RFLP macrorestriction map showed that the isolates were grouped into 9 clusters， including genus Pontibacillus， Halobacillus， Oceanobacillus and Bacillus， in which Pontibacillus was the dominant one. Based on the comparison of 16S rRNA gene sequences， the highest similarities of seven strains with the corresponding type strains ranged from 97.4% to 99.0%. The results showed that culturable Bacillus-like species from Yinggehai Saltern sediment revealed high genetic diversity and there existed some novel species.
Key words Bacillus-like species； Diversity； 16S rDNA PCR-RFLP； Phylogeny analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.028
芽胞杆菌为土壤细菌中的常见类群，是一类好氧或兼性厌氧、革兰氏染色多为阳性、能产生芽胞的化能异养型细菌，广泛分布于各种生态环境中，如水体[1]、土壤[2]、深海沉积物[3]。芽胞杆菌种类繁多、数量巨大、能够产生多种生理活性物质和代谢产物。芽胞杆菌在工农业、医药卫生、环保等领域具有广泛的用途，如防治植物病虫害[4]、处理工业废水[5]等。
莺歌海盐场位于海南省乐东县西南部海滨，是中国南方最大的海盐厂，海滩涂地带盐田总面积37.97 km2，占全岛盐田总面积的63%，属人工形成的海洋高盐环境。高盐环境中存在着独特的微生物区系，过去对陆地高盐环境中微生物的研究较多[6-11]，且发现芽胞杆菌属为优势菌群。莺歌海盐场由一系列的晒盐池组成，本研究对莺歌海盐场卤水盐度为30%晒盐池底泥中的可培养芽胞杆菌资源进行分离培养及遗传多样性研究，为了解、利用极端环境中的芽孢杆菌资源奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 底泥样品采集于莺歌海盐场卤水盐度为30%的晒盐池。采用5点采样法采集5～25 cm深的底泥50 g左右，放入无菌采样袋中混合均匀，冰盒储存，及时带回实验室进行菌株分离，剩余样品置4 ℃冰箱中保存备用。
1.1.2 培养基 R2A培养基：1 000 mL中含有可溶性淀粉10 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨0.5 g，酸水解酪素0.5 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸钠0.3 g。PBMY培养基：1 000 mL中含有蛋白胨10 g，酵母膏3 g，牛肉膏0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。改良营养琼脂培养基：1 000 mL中含有牛肉膏0.3 g，蛋白胨1 g。淡薄培养基：1 000 mL中含有酵母膏0.7 g，蛋白胨1 g，葡萄糖1 g，（NH4）2SO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1 g。所有培养基盐浓度15%，采用30%的卤水稀释配制，pH7.0，琼脂粉20～25 g/L。
1.2 方法
1.2.1 芽胞杆菌的分离纯化 称取10 g底泥样品，放入盛有90 mL无菌卤水的三角瓶中，置恒温摇床中振荡30 min（30 ℃、200 r/min）；将得到的悬液稀释至10-1～10-6梯度，80 ℃水浴处理20 min以灭活非芽胞细菌；吸取热处理后的悬液0.1 mL，涂布平板，于30 ℃培养箱中倒置培养，观察菌落形状、颜色等表型特征，挑单菌落划线纯化，直至得到纯培养。 1.2.2 芽胞杆菌16S rDNA PCR-RFLP多样性分析
基因组DNA的提取参照相关文献[12]进行。选用以下引物（由上海生工生物技术有限公司合成）扩增16S rDNA基因：P1（5′-AGAGTTTGATCCTGGCT
CAGAACGAACGCT-3′），P6（5′-TACGGCTACCTTG
TTACGACTTCACCCC-3′）。PCR反应程序为： 95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经MspⅠ（TaKaRa）酶切后，用3%琼脂糖凝胶电泳检测。用NTSYS-pc2.01软件进行相似性分析，采用平均连锁法（UPGMA）聚类，得出菌株间的聚类关系[13]。
1.2.3 16S rDNA序列测定及其系统发育分析
从16S rDNA PCR-RFLP分型的不同遗传类型中，各选取1～2株菌进行16S rDNA测序（由上海生工生物工程有限公司完成）。将测序结果在EzTaxon server 2.1和GenBank 中进行BLAST比较分析。采用MEGA5.0以邻位相连法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 芽胞杆菌的分离
采用80 ℃水浴处理与稀释涂布相结合的方法，从4种培养基上共分离获得芽胞杆菌215株。分离于R2A培养基的72株，占分离总数的33.5%；分离于PBMY培养基的61株，占28.4%；分离于改良营养琼脂培养基的48株，占22.3%；分离于淡薄培养基的34株，占15.8%。在R2A培养基上生长的菌落，形态种类较多，而淡薄培养基上的菌落形态较少。
2.2 莺歌海盐场晒盐池底泥芽胞杆菌遗传多样性
从莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中分离的215株芽胞杆菌，经16S rDNA PCR-RFLP初步分型，每1个限制性片断长度多态性类型代表1种酶切类型，共得到9种酶切类型，从9种类型中选出18株代表菌株的酶切图谱见图1。由代表菌株的聚类树状图（图2）可知，相似系数为0.62时，芽胞杆菌分为2个类群；相似系数为0.81时，分为7个类群；相似系数增大至1.00时，芽胞杆菌可分为9个类群。
2.3 菌株16S rDNA序列测定及其系统发育分析
根据每个遗传型包含的菌株数量及其菌落形态特征，从9种酶切类型中选取15株代表菌进行16S rRNA基因序列的测定。将所得序列在EzTaxon server 2.1和GenBank中进行Blast比对分析。结果显示，莺歌海盐场晒盐池底泥可培养芽胞杆菌资源主要分布在芽胞杆菌科（Bacillaceae）和类芽胞杆菌科（Paenibacillaceae）。其中，Bacillaceae科下包含喜盐芽胞杆菌属（Halobacillus，33.3%）、芽胞杆菌属（Bacillus，占13.3%）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus，6.7%）3个属；Paenibacillaceae科下有Pontibacillus属（占46.7%），为可培养芽孢杆菌的优势属，Halobacillus为次优势属。
通过序列比对还发现，16S rDNA最大同源性在99.3%以上的有8株；同源性在98%～99%的有4株，分别是HB12542（98.0%）、HB12541（98.0%）、HB12547（98.1%）和HB12543（98.9%）；同源性在98%以下的有3株，分别是HB12536（97.7%）、HB12548（97.4%）和HB12569（97.8%）。这6株菌有可能代表着芽胞杆菌的新资源，为潜在的新分类单元。
各菌株间的系统进化关系见图3所示。菌株HB12527与菌株HB12530属于Pontibacillus属，在系统发育树上聚为一簇，亲缘关系较近；菌株HB12535与Pontibacillus yanchengensis聚于一簇，参考其16S rDNA的最大同源性数值（99.7%），推测HB12535可能为Pontibacillus yanchengensis；而HB12536、HB12542、HB12547和HB12569聚于系统发育树上Pontibacillus属的另一簇，同时其16S rDNA最大同源性为97.7%～98.1%，这4株菌可能代表着Pontibacillus属新的分类单元。菌株HB12541与Halobacillus naozhouensis的序列相似性最高（98.0%），但在系统发育树中处于一个相对独立的分支，也可能是潜在的新种，有待于进一步进行多相分类以确定其最终归属地位。
3 讨论与结论
高盐环境微生物具有独特的种群类型，它们具有特殊的生理机制及代谢产物类型，是一类极具开发潜力的生物资源。本文对莺歌海盐场30%盐度晒盐池底泥中可培养芽胞杆菌资源进行研究，从中分离到215株芽胞杆菌，序列分析结果表明，这些菌株分属于Pontibacillus、Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus属，存在较高的多样性；此外，系统发育分析表明，莺歌海高盐环境不同种芽胞杆菌间的进化距离比较接近。
海洋（或沿海）高盐环境中的微生物区系不同于内陆高盐环境[14]。肖炜[6]在研究昆明盐矿古老岩盐沉积中可培养细菌多样性时发现，Bacillus为卤水和盐晶中的优势菌，各占总细菌分离量的26.1%和59.9%。冯二梅等[15]对烟台海域中度嗜盐菌进行了分离鉴定，结果表明这些菌分布于7个属，其中芽胞杆菌有Bacillus、Virgibacillus、Gracilibacillus。在陆地高盐环境的研究中，郑贺云等[7]在研究新疆阿克苏地区盐碱地中细菌多样性时得出，Bacillus为其中的主要类群。潘媛媛等[8]在松嫩平原盐碱地中也发现了Bacillus和Oceanobacillus资源。对新疆不同地区高盐环境中嗜盐菌的研究结果表明，不同高盐地区的嗜盐菌在组成上具有一定的相似性：Bacillus和Halobacillus在这些地区均有分布，但在各地区的优势度不同[9-11]。本研究在莺歌海30%盐度晒盐池底泥中也发现了Halobacillus、Oceanobacillus和Bacillus等嗜盐芽胞杆菌资源，反映出不同高盐环境芽胞杆菌资源在群落组成上具有一定的相似性。但是，本研究中Pontibacillus为优势属，与陆地高盐环境中的不同，这也证明了海洋高盐环境中芽胞杆菌资源的独特性。 本研究还发现了一些潜在的芽孢杆菌新种，莺歌海高盐环境晒盐池底泥中分离的嗜盐菌HB12536与模式菌种Pontibacillus yanchengensis的亲缘关系最近（相似性为97.7%），是Pontibacillus属的潜在新种。Pontibacillus yanchengensis是一株革兰氏阳性、严格好氧的中度嗜盐芽胞杆菌[16]。菌株HB12541与模式菌种Halobacillus naozhouensis的亲缘关系最近（相似性为98.0%），而Halobacillus naozhouensis是一株革兰氏阳性、具有过氧化氢酶活性、好氧的杆状中度嗜盐细菌[17]。中度嗜盐细菌对环境的适应能力极强，分布广泛，能分泌耐高温的胞外酶（淀粉酶、脂肪酶等）和多聚体，可应用于食品工业、酶制剂和化妆品生产、石油回收、基因工程领域以及环境污染的生物修复领域有着广泛的应用前景[18]。由此可见，莺歌海高盐环境晒盐池底泥中存在着较为丰富的芽孢杆菌资源，并且存在一些潜在的芽孢杆菌新种，有待进一步研究开发。
参考文献
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