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【摘要】目的：建立仁青芒觉胶囊中西红花的含量测定方法。方法：采用HPLC法，用光电二极管阵列检测器（DAD），流动相为甲醇-水（50∶50），流速1.0ml/min，检测波长440nm，柱温25℃，对西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ进行定量测定。结果：西红花苷-Ⅰ在0.0336～0.4987μg范围内呈良好的线性关系，r=0.9999，加样回收率为97.43%，RSD=2.18%；西红花苷-Ⅱ在0.0129～0.1818μg范围内呈良好的线性关系，r=0.9998，加样回收率为99.75%，RSD=1.53%结论：该方法操作简便、专属性、重现性好，可有效地控制仁青芒觉胶囊的质量。
【关键词】仁青芒觉胶囊；HPLC；西红花苷-Ⅰ；西红花苷-Ⅱ
【中图分类号】R284.1【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2015）20-0016-03
HPLCdeterminationofcrocin-Ⅰandcrocin-ⅡinRenqingMangjuecapsules
YANGBohan1ZHUXujiang*
1.TianjinInstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences，Tianjin300020，China；2.GansuInstituteforDrugControl，Lanzhou730070，China
Abstract：ObjectiveTosetupthequalitystandardofRenqingMangjuecapsules.MethodsThecontentofcrocin-Ⅰandcrocin-ⅡweredeterminedbyHPLC，whichconductedwithaDADdetectorandthedetectionwavelengthsetat440nm.ThecolumnwasC18（4.6mm×250mm，5μm）withmobilephaseconsistedofmethanol-water（50：55）andtheflowratewas1.0ml·min-1.Thecolumntemperaturemaintainedat25℃.ResultsHPLCdeterminedthatcrocin-Ⅰwasinrangefrom0.0336to0.4987μg，whichpresentedagoodlinearrelationship（r=0.9999）.Theaveragerecoverywas97.43%，RSDwas2.18%.HPLCdeterminedthatcrocin-Ⅱwasinrangefrom0.0129to0.1818μg，whichpresentedagoodlinearrelationship（r=0.9998）.Theaveragerecoverywas99.75%，RSDwas1.53%.ConclusionThemethodissimpleinoperation.Theresultsareaccurate，reliableandgoodinreproducibility.ThemethodcaneffectivelycontrolthequalityofRenqingMangjuecapsules.
Keywords：RenqingMangjuecapsules；HPLC；crocin-Ⅰ；crocin-Ⅱ
仁青芒觉始载于《盘德琼乃》，是藏族验方。仁青芒觉胶囊由毛诃子、蒲桃、西红花、木香、丁香、朱砂、马钱子等药材组成的复方制剂，具有清热解毒，益肝养胃，明目醒神，愈疮，滋补强身的功效。其现行标准为国家食品药品监督管理局标准（YBZ07062005-2010Z），含量测定项为检查没食子酸的含量，但处方中多味药材含有没食子酸，故该法的专属性不强。仁青芒觉胶囊处方组成比较复杂，含量测定存在一定难度，导致该药含量测定研究报道较少[1-3]。处方中的西红花为鸢尾科植物番红花（CrocussativusL.）的干燥柱头，系贵重药材，具有活血化瘀，清热解毒，解郁安神的作用，且仁青芒觉胶囊为保密处方，处方量不明确。为了保证用药的有效性，试验采用高效液相色谱法建立了仁青芒觉胶囊中西红花苷-I和西红花苷-Ⅱ的含量测定方法，该法操作简便、结果准确，可用于产品内在质量的控制。
1仪器与试药
1.1仪器Waterse2695高效液相色谱仪（Waters2998DAD检测器，Empower色谱工作站，美国Waters公司）；MettlerAE240电子天平（瑞士梅特勒）；SartoriusR200D电子天平（德国赛多利斯公司）；KH-500DE超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；HGC-24A氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。
1.2试药西红花苷-I（批号：111588-200501）和西红花苷-Ⅱ（批号：110589-201304，含量92.4%）均购自中国食品药品检定研究院；仁青芒觉胶囊（批号：100501、120001、130101）由甘肃省某藏药企业提供。甲醇（色谱纯，德国默克Merck公司）；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2方法
2.1色谱条件色谱柱：资生堂CAPCELLPAKC18（4.6mm×250mm，5μm），WatersSymmetryC18（4.6mm×250mm，5μm），ThermoscientificBDSHYPERSILC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-水（50：50）；流速：1ml/min；柱温：25℃；检测波长：440nm。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取西红花苷-Ⅰ对照品8.28mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，作为西红花苷-Ⅰ对照品储备液。精密称取西红花苷-Ⅱ对照品8.20mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，作为西红花苷-Ⅱ对照品储备液。分别精密吸取西红花苷-Ⅰ对照品储备液5ml和西红花苷-Ⅱ对照品储备液2ml至50ml容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液。 2.2.2供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加稀乙醇适量，置冰浴中超声处理（功率200W，频率60KHz）30min，放至室温，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3阴性供试品的制备按照供试品溶液的制备方法，分别制备缺西红花的阴性供试品溶液。
2.2.4样品的测定按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各5～10μl，注入液相色谱仪，测得液相色谱图，结果见图1。结果表明，西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ色谱分离良好，且阴性对测定结果无干扰。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系的考察取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项的色谱条件，分别进样2、4、8、10、14、18、22、26、30μl，测定西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的峰面积，以进样对照品质量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。结果表明，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ在线性范围内呈良好的线性关系。
表1西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的线性回归方程
2.3.2精密度实验精密吸取同一份供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积积分值，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的RSD分别为0.5%和0.4%，结果表明进样精密度良好。
2.3.3稳定性试验取同一供试品溶液（批号：130001）分别在0、2、4、6、8、24h，按“2.1”项的色谱条件各进样1次，记录峰面积积分值，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的RSD分别为1.4和1.3%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.3.4重复性试验取同一批供试品（批号：130001）6份，按“2.2.2”项下方法处理，“2.1”项的色谱条件测定含量。结果西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的RSD分别为0.98%和1.02%。
2.3.5加样回收率精密量取西红花苷-Ⅰ对照品储备液（0.1656mg/ml）1.5、2.0、2.5ml各3份和西红花苷-Ⅱ对照品储备液（0.06061mg/ml）0.8、1.0、1.2ml各3份，置50ml棕色量瓶中，溶剂采用氮吹仪吹干，再分别精密称取已知含量同一批号（批号：130001，西红花苷-Ⅰ含量1.2605mg/g；西红花苷-Ⅱ含量0.4376mg/g）的供试品9份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的回收率。结果见表2、表3。
表2西红花苷-Ⅰ加样回收率
表3西红花苷-Ⅱ加样回收率
序号 样品量
/g 西红花苷-Ⅱ原有量
/mg 西红花苷-Ⅱ加入量
/mg 测得总量
/mg 回收率
/% 平均回收率
/% RSD/%
99.751.53
2.4样品测定结果按供试品溶液的制备方法和测定方法，对样品进行制备和测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进样分析，按外标法以峰面积计算样品中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量，测定3批供试品的含量，结果见表4。
表4仁青芒觉胶囊含量测定结果
3讨论
3.1提取方法的选择参考中国药典[4]及有关文献[5-6]，提取溶剂选定为稀乙醇。西红花苷文献报道较多[7-8]，大多采用超声提取方法。西红花苷为水溶性类胡萝卜素类成分，分子中具有多个共轭双键，导致其稳定性差，且对温度非常敏感[9]。研究对供试品在冰浴中和常温下超声处理方法进行了对比研究。结果表明，冰浴比常温提取所测得的西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ峰面积略高，故采用冰浴超声提取作为仁青芒觉胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的提取方法。
3.2超声时间的选择根据预实验的结果，供试品制备采用冰浴中分别超声（功率200W，频率60KHz）20、25、30、40、50min，依法测定峰面积，结果表明，超声提取30min时的测定值略高，故选择提取时间为30min。
3.3测定波长的选择对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ进行全波长扫描，结果在440nm波长处有最大吸收，故选择440nm作为测定波长。
3.4方法适用性试验取同一批样品按供试品溶液的制备方法进行制备，分别采用三种品牌的色谱柱测定，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ测得含量的RSD分别为1.92%和1.56%，结果无明显差别，说明该方法适用性较好。
3.5小结样品各批次间西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量差异较大，说明现行的质量标准不能控制产品质量，使各批样品的投料量存在差异。实验采用HPLC法同时测定仁青芒觉胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量，此法方便可靠、重现性好，为仁青芒觉胶囊的质量控制与评价提供了参考资料。参考文献
[1]田薇，陈朝晖.薄层色谱法检查仁青芒觉胶囊中乌头碱、士的宁的限量[C].甘肃省化学会成立六十周年学术报告会暨二十三届年会论文集，2003，419.
[2]马宁，朱旭江，杨锡，等.仁青芒觉胶囊质量标准研究[J].中国中医药信息杂志，2014，21（6）：72-75.
[3]房少新，赵利平.藏药仁青芒觉中微量元素的测定[J].光谱实验室，2013，30（2）：916-919.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
[5]周素娣，仲惠娟.HPLC测定西红花提取物及其片剂中各西红花苷含量[J].药物分析杂志，1998，18（3）：159-162.
[6]李彬，周素娣，周锦祥.中药西红花指纹图谱研究[J].海峡药学，2005，17（3）：83-85.
[7]尼珍，阿萍，格桑索朗.HPLC法测定藏药二十五味珍珠丸中西红花苷Ⅰ的含量[J].药物分析杂志，2011，31（1）：151-153.
[8]缪玉山，黄根林，倪冲，等.反相高效液相色谱法对不同来源西红花药材中西红花苷-1、苷-2的定量分析[J].中国药学杂志，2002，22（11）：654-656.
[9]付小梅，王峥涛.西红花苷-Ⅰ的稳定性研究[J].食品科学，2012，33（5）：71-73.：
（收稿日期：2015.07.10）
【关键词】仁青芒觉胶囊；HPLC；西红花苷-Ⅰ；西红花苷-Ⅱ
【中图分类号】R284.1【文献标志码】A【文章编号】1007-8517（2015）20-0016-03
HPLCdeterminationofcrocin-Ⅰandcrocin-ⅡinRenqingMangjuecapsules
YANGBohan1ZHUXujiang*
1.TianjinInstituteofMedicalandPharmaceuticalSciences，Tianjin300020，China；2.GansuInstituteforDrugControl，Lanzhou730070，China
Abstract：ObjectiveTosetupthequalitystandardofRenqingMangjuecapsules.MethodsThecontentofcrocin-Ⅰandcrocin-ⅡweredeterminedbyHPLC，whichconductedwithaDADdetectorandthedetectionwavelengthsetat440nm.ThecolumnwasC18（4.6mm×250mm，5μm）withmobilephaseconsistedofmethanol-water（50：55）andtheflowratewas1.0ml·min-1.Thecolumntemperaturemaintainedat25℃.ResultsHPLCdeterminedthatcrocin-Ⅰwasinrangefrom0.0336to0.4987μg，whichpresentedagoodlinearrelationship（r=0.9999）.Theaveragerecoverywas97.43%，RSDwas2.18%.HPLCdeterminedthatcrocin-Ⅱwasinrangefrom0.0129to0.1818μg，whichpresentedagoodlinearrelationship（r=0.9998）.Theaveragerecoverywas99.75%，RSDwas1.53%.ConclusionThemethodissimpleinoperation.Theresultsareaccurate，reliableandgoodinreproducibility.ThemethodcaneffectivelycontrolthequalityofRenqingMangjuecapsules.
Keywords：RenqingMangjuecapsules；HPLC；crocin-Ⅰ；crocin-Ⅱ
仁青芒觉始载于《盘德琼乃》，是藏族验方。仁青芒觉胶囊由毛诃子、蒲桃、西红花、木香、丁香、朱砂、马钱子等药材组成的复方制剂，具有清热解毒，益肝养胃，明目醒神，愈疮，滋补强身的功效。其现行标准为国家食品药品监督管理局标准（YBZ07062005-2010Z），含量测定项为检查没食子酸的含量，但处方中多味药材含有没食子酸，故该法的专属性不强。仁青芒觉胶囊处方组成比较复杂，含量测定存在一定难度，导致该药含量测定研究报道较少[1-3]。处方中的西红花为鸢尾科植物番红花（CrocussativusL.）的干燥柱头，系贵重药材，具有活血化瘀，清热解毒，解郁安神的作用，且仁青芒觉胶囊为保密处方，处方量不明确。为了保证用药的有效性，试验采用高效液相色谱法建立了仁青芒觉胶囊中西红花苷-I和西红花苷-Ⅱ的含量测定方法，该法操作简便、结果准确，可用于产品内在质量的控制。
1仪器与试药
1.1仪器Waterse2695高效液相色谱仪（Waters2998DAD检测器，Empower色谱工作站，美国Waters公司）；MettlerAE240电子天平（瑞士梅特勒）；SartoriusR200D电子天平（德国赛多利斯公司）；KH-500DE超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；HGC-24A氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）。
1.2试药西红花苷-I（批号：111588-200501）和西红花苷-Ⅱ（批号：110589-201304，含量92.4%）均购自中国食品药品检定研究院；仁青芒觉胶囊（批号：100501、120001、130101）由甘肃省某藏药企业提供。甲醇（色谱纯，德国默克Merck公司）；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
2方法
2.1色谱条件色谱柱：资生堂CAPCELLPAKC18（4.6mm×250mm，5μm），WatersSymmetryC18（4.6mm×250mm，5μm），ThermoscientificBDSHYPERSILC18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-水（50：50）；流速：1ml/min；柱温：25℃；检测波长：440nm。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备精密称取西红花苷-Ⅰ对照品8.28mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，作为西红花苷-Ⅰ对照品储备液。精密称取西红花苷-Ⅱ对照品8.20mg，至50ml棕色量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，作为西红花苷-Ⅱ对照品储备液。分别精密吸取西红花苷-Ⅰ对照品储备液5ml和西红花苷-Ⅱ对照品储备液2ml至50ml容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液。 2.2.2供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，研细，取约0.5g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加稀乙醇适量，置冰浴中超声处理（功率200W，频率60KHz）30min，放至室温，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3阴性供试品的制备按照供试品溶液的制备方法，分别制备缺西红花的阴性供试品溶液。
2.2.4样品的测定按“2.1”项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性供试品溶液各5～10μl，注入液相色谱仪，测得液相色谱图，结果见图1。结果表明，西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ色谱分离良好，且阴性对测定结果无干扰。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系的考察取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项的色谱条件，分别进样2、4、8、10、14、18、22、26、30μl，测定西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ的峰面积，以进样对照品质量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表1。结果表明，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ在线性范围内呈良好的线性关系。
表1西红花苷Ⅰ和西红花苷Ⅱ的线性回归方程
2.3.2精密度实验精密吸取同一份供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定峰面积积分值，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的RSD分别为0.5%和0.4%，结果表明进样精密度良好。
2.3.3稳定性试验取同一供试品溶液（批号：130001）分别在0、2、4、6、8、24h，按“2.1”项的色谱条件各进样1次，记录峰面积积分值，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的RSD分别为1.4和1.3%，表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.3.4重复性试验取同一批供试品（批号：130001）6份，按“2.2.2”项下方法处理，“2.1”项的色谱条件测定含量。结果西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的RSD分别为0.98%和1.02%。
2.3.5加样回收率精密量取西红花苷-Ⅰ对照品储备液（0.1656mg/ml）1.5、2.0、2.5ml各3份和西红花苷-Ⅱ对照品储备液（0.06061mg/ml）0.8、1.0、1.2ml各3份，置50ml棕色量瓶中，溶剂采用氮吹仪吹干，再分别精密称取已知含量同一批号（批号：130001，西红花苷-Ⅰ含量1.2605mg/g；西红花苷-Ⅱ含量0.4376mg/g）的供试品9份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的回收率。结果见表2、表3。
表2西红花苷-Ⅰ加样回收率
表3西红花苷-Ⅱ加样回收率
序号 样品量
/g 西红花苷-Ⅱ原有量
/mg 西红花苷-Ⅱ加入量
/mg 测得总量
/mg 回收率
/% 平均回收率
/% RSD/%
99.751.53
2.4样品测定结果按供试品溶液的制备方法和测定方法，对样品进行制备和测定，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，按“2.1”项下色谱条件进样分析，按外标法以峰面积计算样品中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ含量，测定3批供试品的含量，结果见表4。
表4仁青芒觉胶囊含量测定结果
3讨论
3.1提取方法的选择参考中国药典[4]及有关文献[5-6]，提取溶剂选定为稀乙醇。西红花苷文献报道较多[7-8]，大多采用超声提取方法。西红花苷为水溶性类胡萝卜素类成分，分子中具有多个共轭双键，导致其稳定性差，且对温度非常敏感[9]。研究对供试品在冰浴中和常温下超声处理方法进行了对比研究。结果表明，冰浴比常温提取所测得的西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ峰面积略高，故采用冰浴超声提取作为仁青芒觉胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的提取方法。
3.2超声时间的选择根据预实验的结果，供试品制备采用冰浴中分别超声（功率200W，频率60KHz）20、25、30、40、50min，依法测定峰面积，结果表明，超声提取30min时的测定值略高，故选择提取时间为30min。
3.3测定波长的选择对西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ进行全波长扫描，结果在440nm波长处有最大吸收，故选择440nm作为测定波长。
3.4方法适用性试验取同一批样品按供试品溶液的制备方法进行制备，分别采用三种品牌的色谱柱测定，西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ测得含量的RSD分别为1.92%和1.56%，结果无明显差别，说明该方法适用性较好。
3.5小结样品各批次间西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量差异较大，说明现行的质量标准不能控制产品质量，使各批样品的投料量存在差异。实验采用HPLC法同时测定仁青芒觉胶囊中西红花苷-Ⅰ和西红花苷-Ⅱ的含量，此法方便可靠、重现性好，为仁青芒觉胶囊的质量控制与评价提供了参考资料。参考文献
[1]田薇，陈朝晖.薄层色谱法检查仁青芒觉胶囊中乌头碱、士的宁的限量[C].甘肃省化学会成立六十周年学术报告会暨二十三届年会论文集，2003，419.
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[3]房少新，赵利平.藏药仁青芒觉中微量元素的测定[J].光谱实验室，2013，30（2）：916-919.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
[5]周素娣，仲惠娟.HPLC测定西红花提取物及其片剂中各西红花苷含量[J].药物分析杂志，1998，18（3）：159-162.
[6]李彬，周素娣，周锦祥.中药西红花指纹图谱研究[J].海峡药学，2005，17（3）：83-85.
[7]尼珍，阿萍，格桑索朗.HPLC法测定藏药二十五味珍珠丸中西红花苷Ⅰ的含量[J].药物分析杂志，2011，31（1）：151-153.
[8]缪玉山，黄根林，倪冲，等.反相高效液相色谱法对不同来源西红花药材中西红花苷-1、苷-2的定量分析[J].中国药学杂志，2002，22（11）：654-656.
[9]付小梅，王峥涛.西红花苷-Ⅰ的稳定性研究[J].食品科学，2012，33（5）：71-73.：
（收稿日期：2015.07.10）