研究背景:全球流行病学调查显示大肠癌是女性第二位高发肿瘤,在男性中也高居第三位。我国大肠癌的发病日渐增多,发病趋势逐渐向欧美靠拢。结直肠癌的转移与患者的预后密切相关,当结直肠癌确诊时,已经有20%～40%病例发生了远处转移,而治愈性根治术后再发的肝转移率约为50%;结直肠癌死亡的患者肝转移率高达45%～71%。通过外科手术治疗,大肠癌的5年生存率一直在50%左右徘徊。因而,加强结直肠癌发生发展机制的应用基础研究,寻找可靠的预测指标和有效的治疗靶点和手段,对于提高结直肠癌治愈率,减少死亡率具有重要的科学意义。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程,每一阶段都受多种基因/蛋白的调控。目前认为,转移的肿瘤细胞经历了粘附特性的丧失、运动能力的增强、表达蛋白水解酶及新生血管形成等一系列改变,其中肿瘤细胞运动行为的改变和运动能力的增强是其侵袭和转移所必不可少的。研究发现,当遇到各种细胞内外信号刺激时,肿瘤细胞能随时、精确地改变形状和运动行为,如细胞变扁平或呈圆形,改变极性,伸长和收缩或与周围细胞产生或丧失联系,所有这些动态活动均需要肌动蛋白和微管蛋白的不断重建。Pinin(PNN)又称为 DRS,DRSP,SDK3,memA,位于 14q21.1,包含 9 个外显子序列,只有一个转录本,CDS(coding sequence)区长度为2154碱基对(base pair bp)。PNN是最早发现的一个桥粒相关分子(desmosome-associated molecule),它不参与桥粒蛋白的组成,但是与成熟桥粒之间有密切的关系。在桥粒存在的位置,PNN蛋白与丝状角蛋白垂直排列,虽然它不参与中间丝与桥粒的结合,但是可加强桥粒蛋白与中间丝的作用而加强细胞与细胞间的粘连。PNN不但在桥粒结合处有明显表达,而且在细胞核中也有表达。对PNN的结构分析及功能研究发现其可能在肿瘤的发生、发展中发挥抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用。PNN与E-钙的E-box之间发生相互作用,从而逆转CtBP-1引起的E-钙表达下降,进一步影响肿瘤的粘附、侵袭和转移能力。除此之外,PNN还参与了前体mRNA的剪切过程。作为SR家族的成员,PNN可通过与SR家族成员相互作用而发挥不同的剪切功能。需要重点指出的是有研究通过对PNN基因的位置和蛋白结构的分析,并用初步实验证明PNN可能在肿瘤的发生发展中发挥抑制作用及其在细胞的粘附中发挥的重要作用。正是基于这两点说明PNN很可能在肿瘤转移上发挥着重要作用,而在结直肠癌中,关于PNN的研究鲜有报道,因此PNN在结直肠癌发生、发展的过程中对结直肠癌细胞生长、侵袭和转移的作用值得进一步研究。本研究拟通过GEO数据库分析PNN在各个肿瘤中的作用;并利用体外实验研究干扰和过表达PNN对结直肠癌细胞的生物学功能的影响;进一步建立动物模型在体内探讨其对肿瘤转移的影响;并通过检测和对比PNN在正常组织和肿瘤组织中的表达,分析PNN与肿瘤分期、肿瘤分化、淋巴结转移、远处转移的关系以及对预后的影响;最后通过对PNN的作用机制进行探讨,揭示PNN在结直肠癌发挥作用的原理,为结直肠癌预后的判断和治疗提供新的基因靶点。研究目的:1.揭示PNN在结直肠癌细胞生长、侵袭和转移中发挥的作用及其作用机制。2.检测PNN在正常组织和配对肿瘤组织中的表达情况,判断PNN在预测结直肠癌预后的价值。3.进一步明确结直肠癌转移的机制和特点,为结直肠癌的诊断和治疗提供新的指标和靶点。方法:1.利用荧光实时定量PCR技术在mRNA水平检测PNN在正常组织和配对肿瘤组织中的表达并将之与患者临床病理因素进行相关性分析。2.利用公共芯片数据库数据(GEO数据库)分析PNN在结直肠癌及其他恶性肿瘤中的表达情况并进行相关临床病理及预后分析。3.利用转染技术进行细胞体外实验,分析PNN干扰和过表达对细胞增殖能力、克隆形成能力、迁移和侵袭能力的影响。4.建立稳定PNN干扰和过表达细胞株,利用裸鼠模型进行皮下成瘤和尾静脉注射实验,分析PNN干扰和过表达对肿瘤生长和转移的影响。5.利用细胞转染技术,分析PNN干扰和过表达对E-ca、DSG2、EGFR、p-EGFR、ERK和p-ERK表达的影响。6.利用细胞转染技术结合ERK通路抑制剂处理,分析PNN高表达情况下,对ERK通路进行抑制,对细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。7.利用免疫印迹在蛋白表达水平检测PNN在正常组织和配对肿瘤组织中的表达情况,对比PNN在正常组织和肿瘤组织中的表达。8.利用免疫组化分析PNN在石蜡组织中的表达,进行临床病理分析和预后分析。结果:1.PNN在结直肠癌组织中的表达(1)荧光实时定量PCR检测PNN在正常组织和配对肿瘤组织中的表达显示,PNN在肿瘤组织中表达显著高于正常组织。(2)PNN在肿瘤组织中的表达与患者肿瘤T分期和转移存在密切关系。2.公共数据库分析PNN在结直肠癌及其他肿瘤组织中的表达(1)GEO数据库分析PNN在结直肠癌组织中高表达,且在177例患者结直肠癌芯片数据库分析PNN的表达发现PNN的表达与患者肿瘤转移存在密切关系,且与患者预后密切相关。(2)在胃癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌中,GEO数据库分析结果显示PNN在肿瘤组织中的表达都要高于正常组织。3.干扰和过表达PNN对结直肠癌细胞的生物学行为的影响(1)干扰结直肠癌细胞株SW620中PNN的表达抑制细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力。(2)过表达结直肠癌细胞株SW480中PNN的表达促进细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能。4.干扰或过表达PNN对结直肠癌生长和转移的影响(1)干扰PNN抑制结直肠癌细胞在荷瘤裸鼠皮下的生长,并抑制结直肠癌细胞的转移能力。(2)过表达PNN促进结直肠癌细胞在荷瘤裸鼠皮下的生长,并促进结直肠癌细胞的转移能力。5.PNN的下游调控机制(1)在结直肠癌细胞株SW620中干扰PNN的表达抑制了 DSG2的表达,并且抑制EGFR/ERK信号通路的激活。(2)在结直肠癌细胞株SW480中过表达PNN促进DSG2的表达,并且促进EGFR/ERK信号通路的激活。(3)在结直肠癌细胞株SW480中过表达PNN后,加入ERK信号通路阻滞剂,与加入DMSO的对照组相比,细胞中ERK信号通路的激活显著受到抑制。(4)ERK信号通路阻滞剂可抑制过表达PNN引起的细胞生物学行为的改变。6.PNN在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理学的关系(1)与配对正常新鲜组织相比,新鲜肠癌组织中PNN的表达增高。(2)在结直肠癌石蜡组织标本中,PNN的表达要高于正常组织,且PNN的表达与浸润深度、淋巴结转移和远处转移密切相关。(3)在结直肠癌组织中高表达PNN的患者的预后要显著差于低表达患者。结论1.胃癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和结直肠癌组织中PNN的表达水平显著上调,且PNN的表达水平与患者预后存在密切关系。2.结直肠癌细胞中PNN的表达与细胞的增殖、克隆生长、迁移和侵袭密切相关。PNN的表达还与结直肠癌细胞在裸鼠体内的生长和转移密切相关。3.PNN可通过促进DSG2的表达从而促进EGFR/ERK信号通路的激活,促进结直肠癌的生长和转移。4.PNN的表达水平与结直肠癌的T分期、淋巴结转移和远处转移密切相关,可作为一个结直肠癌预后判断分子标记物。