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为了建立更加快速高效的测定肉制品中核苷酸的方法，文章以6种5′-单核苷酸钠盐（肌苷-5′-单磷酸二钠（5′-IMP）、鸟苷-5′-单磷酸二钠（5′-GMP）、胞苷-5′-单磷酸二钠（5′-CMP）、腺苷-5′-单磷酸二钠（5′-AMP）、尿苷-5′-单磷酸二钠（5′-UMP）、黄苷-5′-单磷酸二钠（5′-XMP））为标准品，制备混合标准溶液，通过色谱条件优化，建立了可同时测定这6种5′-单核苷酸的HPLC方法。具体色谱条件：C18色谱柱，以甲醇（2%～15%）和0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（98%～85%）为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长250 nm,柱温30℃,进样量10μL。在该检测条件下，6种5′-单核苷酸均能较好分离，线性相关系数均大于0.99。将该方法用于冷鲜调理猪肉进行验证，发现其中的6种5′-单核苷酸均能一次性检出，每种5′-单核苷酸的加标回收率在89%～126%之间，RSD值在0.04%～2.21%之间。方法学验证结果表明，该方法操作便捷，准确度高，重现性好，可以用于肉制品中核苷酸含量的测定。