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摘 要 本实验以无致病力青枯菌为材料，针对烟草青枯病进行了控病及机理的初步研究。结果显示，温室控病中各菌株伤根接种相对防效高于灌根接种，Aujd5-2y温室控病相对防效为80.49%，其田间相对防效高于农用链霉素，其抗药性突变株在烟草根表和体内可短暂定殖。Au004-1、Tmjd1-3可诱导烟草产生抗病性生理生化变化，表现为PAL、POD、PPO活性增加，病程相关蛋白量的积累。
关键词 无致病力菌株；烟草青枯病；生物防治
中图分类号：S476+.1 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2014）27--04
烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种系统性土传病害，在烟草苗期和大田期均可能发生。该病广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖的地区，一旦发生即造成全株死亡，对烟草的产量和质量影响极大。利用青枯无致病力·菌株对青枯病菌进行防治的报道已有很多，但用到生产上的很少。对其控病机制目前主要有两种观点：一是认为细菌素是主要的控病因子；二是认为诱导了寄主的抗病性。朱育菁等通过研究强致病力与无致病力菌株生长竞争关系，认为无致病产细菌素的青枯劳尔氏菌对青枯病具有较好的短期防效，除了细菌素和诱导抗性外，可能还与菌株之间的生态竞争有关。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：无致病力青枯菌Tbw1-7-1-1、Tb1-7-1-3、Tm002-2r、Tbw1-7-3、Aujd5-2y、 Au004-1、Tmjd1-3，致病菌FL-9-1；烟草品种：MSK326；对照药剂：农用链霉素（石家庄曙光制药厂）；抗生素：注射用硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）、利福平（成都锦华药业股份有限责任公司）。
1.2 方法
1.2.1 烟草青枯病温室控病试验
待测菌为Tbw1-7-1-1、Tb1-7-1-3、Tm002-2r、Tbw1-7-3、Aujd5-2y，采用伤根和灌根接种。灌接接种：选取5～7叶烟苗，4.0×108 cfu/mL ，10 mL/株，灌接待测菌发酵液，每菌10株，3次重复。7 d后伤根灌接FL-9-1，3.0×108 cfu/mL，10 mL/株，放于30℃温室中待其发病。伤根接种参考郑继法的方法，菌液浓度和量同灌根接种。设置药剂对照（CK药，农用链霉素100 μg/mL，10 mL/株灌根）、空白对照（CK空白）和发病对照（CK病）。分级标准参照肖永生等。
1.2.2 烟草青枯病田间小区控病试验
烟苗移栽前7 d将FL-9-1发酵液200 mL/m2均匀喷雾到土中制备病圃，浓度为3.0×108 cfu/mL。移栽前7 d将待测菌发酵液10 mL/株灌在烟苗根部，移栽后7 d及见到CK病发病时，待测菌发酵液100 mL/株各灌根一次，浓度均为8×108 cfu/mL。CK药：移栽后7 d、见到CK病发病时各用 150 μg/mL农用链霉素100 mL/株灌根。
1.2.3 抗药性标记及在烟草体内的定殖
对Aujd5-2y进行抗药性标记，对得到的突变株检测平板抑菌活性。突变株接种方法、浓度、量、时间及烟苗的管理方式与温室控病试验一致。组织印迹法、稀释平板法检测：两种方法处理后第0.5、3、7、14、21、30 d分别进行检测。
1.2.4 青枯菌无致病力菌株诱导烟草抗病性
接种处理：伤根接种（同温室控病），CK灌等量无菌水。分别在处理后1、3、5、7、9、11 d后采集叶片（从上向下第四张完全展开叶片），每个样重复3次，取平均值。
苯丙氨酸解氨酶（PAL）提取及活性测定、过氧化物酶（POD）的提取及活性测定，多酚氧化酶（PPO）的提取及活性测定。病程相关蛋白（PRP）的提取及电泳：将待测菌株菌悬液伤根灌接，以灌施等量无菌水为对照。3 d后采集处理植株的第4～6片叶0.5 g，除去主脉，参照江山等、Boller T H的细胞间隙可溶性蛋白的提取法，提取溶液经电泳分析。
2 结果与分析
2.1 温室控病试验
本试验将5个无致病力菌株用于温室盆栽控病试验。接种青枯致病菌28 d后，CK空白未见有发病，菌株Tbw1-7-3、Aujd5-2y伤根处理在接种青枯菌7 d后未出现青枯症状，其它菌株处理已在发病，可见这两个菌株可推迟烟草青枯病发病，28 d后这两个菌株伤根接种的相对防效为80.49%，较CK药及其它菌株处理高，且差异显著，各菌株伤根接种相对防效大于灌根的相对防效（见表1）。
表1 温室控病试验结果
处理 接种方法 发病率（%） 病情指数 相对防效（%）
CK病
CK药
Tbw1-7-3
Aujd5-2y
Tm002-2r
Tbw1-7-1-3
Tbw1-7-1-1
不伤根
伤根
不伤根
伤根
不伤根
伤根
不伤根
伤根
不伤根
伤根 80.00
26.67
26.67
20.00
26.67
23.33
40.00
33.33
46.67
43.33
43.33
40.00 68.33
20.00
15.00
13.33
15.83
13.33
32.50 26.67
35.00
33.33
34.17
32.50
73.17a
78.05b
80.49c
76.83d
80.49c
52.44e
60.67f
48.78g
51.22h
49.99i
52.44j
注：不同字母表示在p=0.05水平上差异显著。
2.2 田间小区控病试验
烟苗移栽到田间30 d后，田间发病对照处理开始出现发病植株，以后每5 d调查一次田间发病情况。拮抗菌处理和药剂处理在对照发病后5 d未见发病烟株，烟苗移栽60 d后两菌株处理后对烟草青枯病的相对虽不理想，但菌株Aujd5-2y 处理后对烟草青枯病的相对防效比供试药剂农用链霉素处理后的相对防效高（图1）。
注：图中时间为发病对照发病后天数
图1 田间小区控病试验相对防效
2.3 抗药性标记及在烟草体内的定殖
抗药性标记得到同时抗Stre 250 μg/mL和Rif 200 μg/mL的突变株Aujd5-2yk。该菌株在NA平板上对青枯菌有抑菌活性。两种方法接种该突变株后0.5～28 d组织印迹法都可在根表检测到，而叶、茎表面均未检测到。稀释平板法一定时间后在烟草根、茎、叶内均可检测到，说明该菌可以在烟草体内定殖，且可以转移。伤根接种处理的烟草体内检测到该菌的时间较灌根接种时间早，且检测到的菌量大于同期灌根接种处理。两种方法处理后烟草体内菌量都呈现先上升后下降的趋势，说明该菌株在烟草体内只能短暂定殖（图2，图3，图4）。
图2 Aujd5-2yk在烟草根内的消长动态
图3 Aujd5-2yk在烟草茎内的消长动态
图4 Aujd5-2yk在烟草叶内的消长动态
2.4 青枯无致病力菌株诱导烟草抗病性
Au004-1处理后，烟叶中PAL活性逐渐上升后下降，上升后再次下降，在第5、9 d分别达到峰值，与CK的变化一致，在11 d内大部分时间高于CK（见图5）；POD活性前3 d低于CK，之后迅速增强，5 d后达到最大值后又下降，9 d后达到另一个峰值，随后又下降，并在3～7 d、7～11 d两个时间段大大强于CK（图6），CK则变化较小；PPO活性前3 d低于CK，随后逐渐增强，11 d时达到最大值，其后可能仍有上升的趋势（图7）。Tmjd1-3处理后，烟叶中PAL活性与CK的变化趋势基本一致，且始终高于CK（图5）；POD活性则相对较稳定，且在大部分时间高于CK（见图6）；而PPO变化与CK基本一致，7 d前缓慢上升，其后开始迅速下降，9 d后又迅速上升达到高峰，并一直高于CK，（见图7）。
这些变化表明Au004-1和Tmjd1-3分别诱导烟草产生对青枯病的抗性均与PAL、POD、PPO活性相关。
图5 两菌株处理烟草叶片中PAL活性变化
图6 两菌株处理烟草叶片中POD活性变化
图7 两菌株处理烟草叶片中POD活性变化
与CK比较，两菌株分别处理烟草后，电泳图谱虽没有出现新的蛋白带，但着色较深，尤其Au004-1处理的每个带都比CK的着色深，表明Au004-1和Tmjd1-3分别处理烟草后产生的抗病性与体内产生的PRP有关，主要表现为蛋白量的积累（见图8）。
3 讨论
5个菌株温室控病试验结果显示，伤根接种对烟草青枯病的相对防效大于灌根接种。Aujd5-2y在田间对青枯病有一定的拮抗作用。Aujd5-2yk定殖试验和诱导烟草产生生理生化试验结果显示，无致病力菌株的控病机理应该是定殖位点的占据和诱导烟草产生抗病性，是否与细菌素的产生有关还有待进一步的研究。
任欣正等认为伤口有利于拮抗菌侵入番茄体内，本研究得出了相同的结果。在伤根接种Aujd5-2yk 0.5 d后可在烟草根内分离到，而灌根接种3 d后方能分离到，说明伤根造成的伤口有利于其进入烟草体内。青枯菌进入植物体内的主要通道是伤口，伤根接种在烟草根部造成了伤口，更有利于其进入寄主体内。本试验中伤根处理后在烟草体内分离到的菌量均大于灌根处理，这说明伤根后标记菌株先进入烟草内，优先占据了烟草体内的定殖位点并在烟草体内增殖，因此，分离到的标记菌株数量就多，这也在一定程度上解释了为什么伤根接种拮抗菌相对防效大于灌根接种。
本试验发现Aujd5-2yk可在烟草根表和土壤中存活，且在烟草体内转移并定殖，但不能从体内转移到茎叶表面，其在烟草体内的数量呈现出先上升后下降的趋势，说明该菌在烟草体内只能短暂定殖，原因可能是其它微生物的存在抑制了该菌的增殖，还可能与营养、土壤湿度、环境温度等相关，具体原因还有待进一步的研究。试验结果显示，接种Aujd5-2yk 14天后烟草体内的菌量开始下降，在田间应用中，可在上次施用后10～15 d再次施用，增加寄主体内拮抗菌数量以达到控病的目的。
菌株Au004-1和Tmjd1-3对青枯菌具有体外抑制作用和诱导烟草产生对青枯病的抗病作用，这与前人的研究相似；两菌株分别诱导烟草产生新的PRP，只是表现为含量的增加。这可能是由于试验菌株不是来自烟草本身，而是分别从茄和番茄青枯病株上分离得到，虽然激活了烟草本身的抗病代谢过程，但在这一过程中并没有新PRP产生，这种情况也可能由于新PRP产生量很少或已转化以致检测不到。
参考文献
[1]Hayward A.C. Biology and Epidemiology of Bacterial wilt Caused by Pseudomonas solanacearum [J]. Annu Rev Phytopa?thol，1991，（29）： 65-87. [2]陈庆河，翁启勇，胡方平.无致病力青枯菌株对番茄青枯病的防治效果[J].中国生物防治，2004，（1）：42-44.
[3]郑继法，张建华，许永玉等.利用无毒产细菌素菌株防治烟草细菌性青枯病[J].中国烟草，1994，（3）：21-24.
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[20]肖田，肖崇刚，邹阳等.青枯菌无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用初步研究[J].植物保护，2008，（2）：8，18，28，97.
（责任编辑：刘昀）
关键词 无致病力菌株；烟草青枯病；生物防治
中图分类号：S476+.1 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2014）27--04
烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的一种系统性土传病害，在烟草苗期和大田期均可能发生。该病广泛分布于全世界的热带、亚热带和一些温暖的地区，一旦发生即造成全株死亡，对烟草的产量和质量影响极大。利用青枯无致病力·菌株对青枯病菌进行防治的报道已有很多，但用到生产上的很少。对其控病机制目前主要有两种观点：一是认为细菌素是主要的控病因子；二是认为诱导了寄主的抗病性。朱育菁等通过研究强致病力与无致病力菌株生长竞争关系，认为无致病产细菌素的青枯劳尔氏菌对青枯病具有较好的短期防效，除了细菌素和诱导抗性外，可能还与菌株之间的生态竞争有关。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株：无致病力青枯菌Tbw1-7-1-1、Tb1-7-1-3、Tm002-2r、Tbw1-7-3、Aujd5-2y、 Au004-1、Tmjd1-3，致病菌FL-9-1；烟草品种：MSK326；对照药剂：农用链霉素（石家庄曙光制药厂）；抗生素：注射用硫酸链霉素（华北制药股份有限公司）、利福平（成都锦华药业股份有限责任公司）。
1.2 方法
1.2.1 烟草青枯病温室控病试验
待测菌为Tbw1-7-1-1、Tb1-7-1-3、Tm002-2r、Tbw1-7-3、Aujd5-2y，采用伤根和灌根接种。灌接接种：选取5～7叶烟苗，4.0×108 cfu/mL ，10 mL/株，灌接待测菌发酵液，每菌10株，3次重复。7 d后伤根灌接FL-9-1，3.0×108 cfu/mL，10 mL/株，放于30℃温室中待其发病。伤根接种参考郑继法的方法，菌液浓度和量同灌根接种。设置药剂对照（CK药，农用链霉素100 μg/mL，10 mL/株灌根）、空白对照（CK空白）和发病对照（CK病）。分级标准参照肖永生等。
1.2.2 烟草青枯病田间小区控病试验
烟苗移栽前7 d将FL-9-1发酵液200 mL/m2均匀喷雾到土中制备病圃，浓度为3.0×108 cfu/mL。移栽前7 d将待测菌发酵液10 mL/株灌在烟苗根部，移栽后7 d及见到CK病发病时，待测菌发酵液100 mL/株各灌根一次，浓度均为8×108 cfu/mL。CK药：移栽后7 d、见到CK病发病时各用 150 μg/mL农用链霉素100 mL/株灌根。
1.2.3 抗药性标记及在烟草体内的定殖
对Aujd5-2y进行抗药性标记，对得到的突变株检测平板抑菌活性。突变株接种方法、浓度、量、时间及烟苗的管理方式与温室控病试验一致。组织印迹法、稀释平板法检测：两种方法处理后第0.5、3、7、14、21、30 d分别进行检测。
1.2.4 青枯菌无致病力菌株诱导烟草抗病性
接种处理：伤根接种（同温室控病），CK灌等量无菌水。分别在处理后1、3、5、7、9、11 d后采集叶片（从上向下第四张完全展开叶片），每个样重复3次，取平均值。
苯丙氨酸解氨酶（PAL）提取及活性测定、过氧化物酶（POD）的提取及活性测定，多酚氧化酶（PPO）的提取及活性测定。病程相关蛋白（PRP）的提取及电泳：将待测菌株菌悬液伤根灌接，以灌施等量无菌水为对照。3 d后采集处理植株的第4～6片叶0.5 g，除去主脉，参照江山等、Boller T H的细胞间隙可溶性蛋白的提取法，提取溶液经电泳分析。
2 结果与分析
2.1 温室控病试验
本试验将5个无致病力菌株用于温室盆栽控病试验。接种青枯致病菌28 d后，CK空白未见有发病，菌株Tbw1-7-3、Aujd5-2y伤根处理在接种青枯菌7 d后未出现青枯症状，其它菌株处理已在发病，可见这两个菌株可推迟烟草青枯病发病，28 d后这两个菌株伤根接种的相对防效为80.49%，较CK药及其它菌株处理高，且差异显著，各菌株伤根接种相对防效大于灌根的相对防效（见表1）。
表1 温室控病试验结果
处理 接种方法 发病率（%） 病情指数 相对防效（%）
CK病
CK药
Tbw1-7-3
Aujd5-2y
Tm002-2r
Tbw1-7-1-3
Tbw1-7-1-1
不伤根
伤根
不伤根
伤根
不伤根
伤根
不伤根
伤根
不伤根
伤根 80.00
26.67
26.67
20.00
26.67
23.33
40.00
33.33
46.67
43.33
43.33
40.00 68.33
20.00
15.00
13.33
15.83
13.33
32.50 26.67
35.00
33.33
34.17
32.50
73.17a
78.05b
80.49c
76.83d
80.49c
52.44e
60.67f
48.78g
51.22h
49.99i
52.44j
注：不同字母表示在p=0.05水平上差异显著。
2.2 田间小区控病试验
烟苗移栽到田间30 d后，田间发病对照处理开始出现发病植株，以后每5 d调查一次田间发病情况。拮抗菌处理和药剂处理在对照发病后5 d未见发病烟株，烟苗移栽60 d后两菌株处理后对烟草青枯病的相对虽不理想，但菌株Aujd5-2y 处理后对烟草青枯病的相对防效比供试药剂农用链霉素处理后的相对防效高（图1）。
注：图中时间为发病对照发病后天数
图1 田间小区控病试验相对防效
2.3 抗药性标记及在烟草体内的定殖
抗药性标记得到同时抗Stre 250 μg/mL和Rif 200 μg/mL的突变株Aujd5-2yk。该菌株在NA平板上对青枯菌有抑菌活性。两种方法接种该突变株后0.5～28 d组织印迹法都可在根表检测到，而叶、茎表面均未检测到。稀释平板法一定时间后在烟草根、茎、叶内均可检测到，说明该菌可以在烟草体内定殖，且可以转移。伤根接种处理的烟草体内检测到该菌的时间较灌根接种时间早，且检测到的菌量大于同期灌根接种处理。两种方法处理后烟草体内菌量都呈现先上升后下降的趋势，说明该菌株在烟草体内只能短暂定殖（图2，图3，图4）。
图2 Aujd5-2yk在烟草根内的消长动态
图3 Aujd5-2yk在烟草茎内的消长动态
图4 Aujd5-2yk在烟草叶内的消长动态
2.4 青枯无致病力菌株诱导烟草抗病性
Au004-1处理后，烟叶中PAL活性逐渐上升后下降，上升后再次下降，在第5、9 d分别达到峰值，与CK的变化一致，在11 d内大部分时间高于CK（见图5）；POD活性前3 d低于CK，之后迅速增强，5 d后达到最大值后又下降，9 d后达到另一个峰值，随后又下降，并在3～7 d、7～11 d两个时间段大大强于CK（图6），CK则变化较小；PPO活性前3 d低于CK，随后逐渐增强，11 d时达到最大值，其后可能仍有上升的趋势（图7）。Tmjd1-3处理后，烟叶中PAL活性与CK的变化趋势基本一致，且始终高于CK（图5）；POD活性则相对较稳定，且在大部分时间高于CK（见图6）；而PPO变化与CK基本一致，7 d前缓慢上升，其后开始迅速下降，9 d后又迅速上升达到高峰，并一直高于CK，（见图7）。
这些变化表明Au004-1和Tmjd1-3分别诱导烟草产生对青枯病的抗性均与PAL、POD、PPO活性相关。
图5 两菌株处理烟草叶片中PAL活性变化
图6 两菌株处理烟草叶片中POD活性变化
图7 两菌株处理烟草叶片中POD活性变化
与CK比较，两菌株分别处理烟草后，电泳图谱虽没有出现新的蛋白带，但着色较深，尤其Au004-1处理的每个带都比CK的着色深，表明Au004-1和Tmjd1-3分别处理烟草后产生的抗病性与体内产生的PRP有关，主要表现为蛋白量的积累（见图8）。
3 讨论
5个菌株温室控病试验结果显示，伤根接种对烟草青枯病的相对防效大于灌根接种。Aujd5-2y在田间对青枯病有一定的拮抗作用。Aujd5-2yk定殖试验和诱导烟草产生生理生化试验结果显示，无致病力菌株的控病机理应该是定殖位点的占据和诱导烟草产生抗病性，是否与细菌素的产生有关还有待进一步的研究。
任欣正等认为伤口有利于拮抗菌侵入番茄体内，本研究得出了相同的结果。在伤根接种Aujd5-2yk 0.5 d后可在烟草根内分离到，而灌根接种3 d后方能分离到，说明伤根造成的伤口有利于其进入烟草体内。青枯菌进入植物体内的主要通道是伤口，伤根接种在烟草根部造成了伤口，更有利于其进入寄主体内。本试验中伤根处理后在烟草体内分离到的菌量均大于灌根处理，这说明伤根后标记菌株先进入烟草内，优先占据了烟草体内的定殖位点并在烟草体内增殖，因此，分离到的标记菌株数量就多，这也在一定程度上解释了为什么伤根接种拮抗菌相对防效大于灌根接种。
本试验发现Aujd5-2yk可在烟草根表和土壤中存活，且在烟草体内转移并定殖，但不能从体内转移到茎叶表面，其在烟草体内的数量呈现出先上升后下降的趋势，说明该菌在烟草体内只能短暂定殖，原因可能是其它微生物的存在抑制了该菌的增殖，还可能与营养、土壤湿度、环境温度等相关，具体原因还有待进一步的研究。试验结果显示，接种Aujd5-2yk 14天后烟草体内的菌量开始下降，在田间应用中，可在上次施用后10～15 d再次施用，增加寄主体内拮抗菌数量以达到控病的目的。
菌株Au004-1和Tmjd1-3对青枯菌具有体外抑制作用和诱导烟草产生对青枯病的抗病作用，这与前人的研究相似；两菌株分别诱导烟草产生新的PRP，只是表现为含量的增加。这可能是由于试验菌株不是来自烟草本身，而是分别从茄和番茄青枯病株上分离得到，虽然激活了烟草本身的抗病代谢过程，但在这一过程中并没有新PRP产生，这种情况也可能由于新PRP产生量很少或已转化以致检测不到。
参考文献
[1]Hayward A.C. Biology and Epidemiology of Bacterial wilt Caused by Pseudomonas solanacearum [J]. Annu Rev Phytopa?thol，1991，（29）： 65-87. [2]陈庆河，翁启勇，胡方平.无致病力青枯菌株对番茄青枯病的防治效果[J].中国生物防治，2004，（1）：42-44.
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（责任编辑：刘昀）