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摘要：目的建立同时测定双黄连口服液中连翘苷、牛蒡子苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙4种有效成分含量的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）分析方法。方法采用UPLC-MS/MS技术结合BEHC18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱建立分析方法。利用乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱作为流动相，流速为0.4 mL·min-1，采用电喷雾电离源（ESI），多反应离子监测（MRM）扫描方式进行检测。结果4种被测物呈良好的线性关系（r>0.999）；精密度、重复性和稳定性良好；加样回收率在99.12%～101.40%之间，RSD值均小于3%。结论 所建立的方法准确、快捷，重现性好，可用于双黄连口服液中连翘苷、牛蒡子苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙4种有效成分的含量的同时测定。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；双黄连口服液；木脂素；皂苷类
中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）05-0056-03
双黄连口服液是由黄芩、金银花、连翘通过一定传统水提醇沉工艺精制而成，临床主要用于细菌或病毒引起的上呼吸道感染。前期研究表明金银花、连翘为方解双黄连君药，其抗菌、抗病毒效果显著[1-2]。连翘苷、牛蒡子苷为连翘有效微量成分[3]。而灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙为金银花有效微量成分[4-5]。由于HPLC-UV-ELSD分析条件的限制，使双黄连口服液中这些微量成分无法追踪。近些年，随着质谱（MS）技术的发展。LC-MS技术用于中药质量控制越来越多。本研究采用LC-MS/MS联用技术，快速测定了双黄连口服液中4种有效微量成分的含量，该方法具有准确、快捷、精密度高、灵敏性好等特点，为双黄连制剂提供了一种简单易行的定量方法，可用于该制剂的质量控制和临床研究。
1仪器与试剂
1.1仪器设备超高效液相色谱-TQD质谱联用仪（ACQUITY系统，美国Waters公司），MassLynx V4.1工作站。BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司），MicroCL 21R微量离心机（美国赛默飞世尔科技公司），微量移液器（上海科华实验系统有限公司），默克密理博Synergy超纯水仪（德国Merck公司）。
1.2药品与试剂对照品牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙（成都瑞芬思生物科技有限公司）均为供含量测定用，双黄连口服液为哈药制药三厂生产，批号分别为12022231，10080188，13021633。甲醇（色谱纯，德国Merck公司）、乙腈（色谱纯，德国Merck公司），其余溶剂均为分析纯，水为超纯水。
2分析方法
2.1色谱条件色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；流动相：A为乙腈，B为0.1%的甲酸水；梯度洗脱：0～1.5 min（90%B（90%B），1.5～4.0 min（90%B（40%B），4.0～4.2 min（40%B（10%B），4.2～5.2 min（10%B（10%B），5.2～7 min（10%B（90%B），7.0～8.0 min（90%B（90%B）；流速：0.4 mL·min-1；进样量：5 μL，柱温40 ℃。见图1。
2.2质谱条件Waters三重四级杆串联质谱仪（TQD），离子化方式：电喷雾离子化（ESI），多反应监测离子扫描模式（MRM）测定；主要质谱参数为：毛细管电压4KV，锥孔电压60V，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气体流速800L·Hr-1。四种成分离子对的选择（M/Z）：连翘苷：（ESI+，556.91>309.05），牛蒡子苷：（ESI+，556.91>395.06），灰毡毛忍冬皂苷乙：（ESI+，1421.44>1097.64），川续断皂苷乙：（ESI+，[FL）]
2.3溶液的配制
2.3.1供试品溶液的制备取双黄连口服液1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇20 mL，超声（35kHz）处理20分钟，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。12，000 r/min离心10 min，取上清。用10%（乙腈：甲醇（4：1））含0.4%甲酸及0.5 mM甲酸钠溶液稀释50倍，过0.22 μm有机膜，取上清液5 μL，UPLC-ESI-MS/MS分析。
2.3.2混合对照品溶液的制备精密称取牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品适量，用甲醇（0.1%甲酸）制成每1 mL含牛蒡子苷1.10 μg，连翘苷2.29 μg，灰毡毛忍冬皂苷乙4.81 μg，川续断皂苷乙3.89 μg。4℃保存，备用。
3方法学考察
3.1线性关系与定量限分别精密量取“2.4.2”项下的混合对照品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用初始流动相乙腈-0.1%甲酸水（1：9，v/v）稀释成系列浓度的混合对照品溶液（牛蒡子苷：1100，550，275，137.5，68.75，34.38，17.19，8.59，4.30，2.15 ng·mL-1；连翘苷：2290，1145，572.5，286.25，143.13，71.56，35.78，17.89，8.95，4.47 ng·mL-1；灰毡毛忍冬皂苷乙：4810，2405，1202.5，601.25，300.63，150.31，75.16，37.58，18.79，9.39 ng·mL-1；川续断皂苷乙：3890，1945，972.5，486.25，243.13，121.56，60.78，30.39，15.20，7.60 ng·mL-1）。按照“2.1和2.2”项下的条件进样5 μL测定。以被测组分的质量浓度X（ng·ml-1）为横坐标，以各成分的分子离子峰峰面积均值 Y 为纵坐标进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数及线性范围，以信噪比（S/N）为10来确定各待测组分的定量限。表1显示牛蒡子苷在4.30-1101.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9998，连翘苷在44.17-1413.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9952，灰毡毛忍冬皂苷乙在9.39-4908.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9994，川续断皂苷乙在3.79-3885.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9990。且定量限分别为0.54，5.52，4.70，0.95 ng·mL-1。以上结果表明各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系，且定量限较低。 3.2精密度考察取供试品溶液，重复进样6次，依法测定。结果显示，牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的峰面积相对标准偏差（RSD）值分别为2.43，3.05，3.67，3.09%。结果（表2）表明该方法的精密度良好。
3.3重复性考察按“2.4.1”项下方法制备供试品（12022231）6份，，按“2.1和2.2”条件进样分析，测得此批号中牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙平均含量分别为7.40，635.40，32.11，137.20 μg/mL。RSD值分别为1.53，2.10，1.98，2.11%，结果（表2）表明该方法的重复性良好。
3.4稳定性实验取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定，测得牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰面积的RSD值分别为3.97，3.63，3.93，4.24%。结果（表2）表明供试品溶液在24h内稳定。
3.5加样回收率实验精密吸取已知浓度的供试品溶液9等份，每3份为一组，分别精密加入高、中、低3个浓度的混合标准品溶液后，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液进行测定。计算各成分的回收率。本方法在加样3个浓度水平下，四种成分的加样回收率在95.00%～105%之间，RSD值均小于3%，能够满足双黄连口服液中四种有效成分的含量测定要求。结果见表3。
3.6样品含量测定取3个批号的双黄连口服液，按照“2.3.1”项下方法处理，平行制得各组待测样品溶液3份，进样分析，经计算得牛蒡子苷，连翘苷，灰毡毛忍冬皂苷乙，川续断皂苷乙的含量。具体见表4。
[HT64结论
4.1双黄连口服液的化学成分研究甚多，但多集中于运用HPLC[6]技术来检测并追踪化学成分，并对制剂中具较强紫外吸收且含量较高的成分进行定量分析，但对弱紫外吸收，含量较低且较难分离的成分含量测定分析时则相对困难。作者经过查阅文献发现，目前尚未见到报道用液-质串联的方法同时检测双黄连口服液中多种微量成分含量的报道，本实验首次使用LC-MS/MS联用技术，对双黄连口服液中多种微量成分进行了同时测定。方法简单、可靠、应用性强。
4.2本实验同时选用正离子模式测定4种成分的含量，且分子离子峰均为[M+Na]+。实验过程发现这四种物质[M+Na]+丰度强且稳定。MS/MS亦发现稳定且灵敏度高。
4.3本实验建立的液-质联用方法，可在短时间内快速分离检测双黄连口服液中牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙4种微量成分，该方法经考察，准确，快捷，重现性好，符合中药制剂的相关分析要求，可用于双黄连口服液的质量控制。此外，双黄连口服液的体内研究相对较少，随着液-质联用技术的不断普及，双黄连口服液物质基础研究包括体内研究也将越来越多。本实验为双黄连口服液的质量控制提供了依据，且为该制剂的临床前与临床药代动力学等相关研究提供了一定的参考。
4.4中药制剂定性、定量研究最初为单一指标性成分，随着以色谱质谱联用为代表（LC-MS/MS）的各种分析仪器、分离手段和计算机技术的迅速发展，目前，中药制剂化学成分定[LL]性、定量研究已经广泛采用多指标成分，为阐明中药的物质基础提供了重要手段[7]。由此可见，不断应用新理论、新方法和新技术将会有力的推动中药的现代研究，大大加快对中药物质基础与质量控制的研究。[KH*1D]
参考文献：
[1]Shang XF.，Pan H.，Li MX.，et al.Lonicera japonica Thunb.：Ethnopharmacology，phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine.J.Ethnopharmacol.2011，138：1-21.
[2]Zhou，W.，Tan，X.B.，Shan，J.J.，et al.Study on the Main Components Interaction from Flos Lonicerae and Fructus Forsythiae and Their Dissolution In Vitro and Intestinal Absorption in Rats.2014，Plos one.9，e109619.
[3]方颖，邹国安，刘焱文.连翘的化学成分[J].中国天然药物，2008，6（3）：235-236.
[4]娄红祥，郎伟君，吕木坚.金银花中水溶性化合物的分离与结构确定[J].中草药，1996，27（4）：195.
[5]陈昌祥，王薇薇，倪伟，等.金银花花蕾中的新三帖皂苷[J].云南植物研究，2000，22（2）：201-208.
[6]陈国宝，宋桂萍，杨弃尘.HPLC法同时测定双黄连片中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷的含量[J].中国药房，2011，48：4594-4596.
[7]Wang XJ.，Zhang AH.，Yan GL.，et al.UHPLC-MS for the analytical characterization of traditional Chinese medicines[J].Trends Analyt.Chem.2014，63：180-187.
关键词：超高效液相色谱-串联质谱；双黄连口服液；木脂素；皂苷类
中图分类号：R284.2文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）05-0056-03
双黄连口服液是由黄芩、金银花、连翘通过一定传统水提醇沉工艺精制而成，临床主要用于细菌或病毒引起的上呼吸道感染。前期研究表明金银花、连翘为方解双黄连君药，其抗菌、抗病毒效果显著[1-2]。连翘苷、牛蒡子苷为连翘有效微量成分[3]。而灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙为金银花有效微量成分[4-5]。由于HPLC-UV-ELSD分析条件的限制，使双黄连口服液中这些微量成分无法追踪。近些年，随着质谱（MS）技术的发展。LC-MS技术用于中药质量控制越来越多。本研究采用LC-MS/MS联用技术，快速测定了双黄连口服液中4种有效微量成分的含量，该方法具有准确、快捷、精密度高、灵敏性好等特点，为双黄连制剂提供了一种简单易行的定量方法，可用于该制剂的质量控制和临床研究。
1仪器与试剂
1.1仪器设备超高效液相色谱-TQD质谱联用仪（ACQUITY系统，美国Waters公司），MassLynx V4.1工作站。BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司），MicroCL 21R微量离心机（美国赛默飞世尔科技公司），微量移液器（上海科华实验系统有限公司），默克密理博Synergy超纯水仪（德国Merck公司）。
1.2药品与试剂对照品牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙、川续断皂苷乙（成都瑞芬思生物科技有限公司）均为供含量测定用，双黄连口服液为哈药制药三厂生产，批号分别为12022231，10080188，13021633。甲醇（色谱纯，德国Merck公司）、乙腈（色谱纯，德国Merck公司），其余溶剂均为分析纯，水为超纯水。
2分析方法
2.1色谱条件色谱柱：Waters Acquity BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；流动相：A为乙腈，B为0.1%的甲酸水；梯度洗脱：0～1.5 min（90%B（90%B），1.5～4.0 min（90%B（40%B），4.0～4.2 min（40%B（10%B），4.2～5.2 min（10%B（10%B），5.2～7 min（10%B（90%B），7.0～8.0 min（90%B（90%B）；流速：0.4 mL·min-1；进样量：5 μL，柱温40 ℃。见图1。
2.2质谱条件Waters三重四级杆串联质谱仪（TQD），离子化方式：电喷雾离子化（ESI），多反应监测离子扫描模式（MRM）测定；主要质谱参数为：毛细管电压4KV，锥孔电压60V，脱溶剂温度450℃，脱溶剂气体流速800L·Hr-1。四种成分离子对的选择（M/Z）：连翘苷：（ESI+，556.91>309.05），牛蒡子苷：（ESI+，556.91>395.06），灰毡毛忍冬皂苷乙：（ESI+，1421.44>1097.64），川续断皂苷乙：（ESI+，[FL）]
2.3溶液的配制
2.3.1供试品溶液的制备取双黄连口服液1 mL，置50 mL量瓶中，加50%甲醇20 mL，超声（35kHz）处理20分钟，放置至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀。12，000 r/min离心10 min，取上清。用10%（乙腈：甲醇（4：1））含0.4%甲酸及0.5 mM甲酸钠溶液稀释50倍，过0.22 μm有机膜，取上清液5 μL，UPLC-ESI-MS/MS分析。
2.3.2混合对照品溶液的制备精密称取牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙对照品适量，用甲醇（0.1%甲酸）制成每1 mL含牛蒡子苷1.10 μg，连翘苷2.29 μg，灰毡毛忍冬皂苷乙4.81 μg，川续断皂苷乙3.89 μg。4℃保存，备用。
3方法学考察
3.1线性关系与定量限分别精密量取“2.4.2”项下的混合对照品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用初始流动相乙腈-0.1%甲酸水（1：9，v/v）稀释成系列浓度的混合对照品溶液（牛蒡子苷：1100，550，275，137.5，68.75，34.38，17.19，8.59，4.30，2.15 ng·mL-1；连翘苷：2290，1145，572.5，286.25，143.13，71.56，35.78，17.89，8.95，4.47 ng·mL-1；灰毡毛忍冬皂苷乙：4810，2405，1202.5，601.25，300.63，150.31，75.16，37.58，18.79，9.39 ng·mL-1；川续断皂苷乙：3890，1945，972.5，486.25，243.13，121.56，60.78，30.39，15.20，7.60 ng·mL-1）。按照“2.1和2.2”项下的条件进样5 μL测定。以被测组分的质量浓度X（ng·ml-1）为横坐标，以各成分的分子离子峰峰面积均值 Y 为纵坐标进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数及线性范围，以信噪比（S/N）为10来确定各待测组分的定量限。表1显示牛蒡子苷在4.30-1101.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9998，连翘苷在44.17-1413.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9952，灰毡毛忍冬皂苷乙在9.39-4908.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9994，川续断皂苷乙在3.79-3885.00 ng·mL-1范围内相关系数为0.9990。且定量限分别为0.54，5.52，4.70，0.95 ng·mL-1。以上结果表明各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系，且定量限较低。 3.2精密度考察取供试品溶液，重复进样6次，依法测定。结果显示，牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的峰面积相对标准偏差（RSD）值分别为2.43，3.05，3.67，3.09%。结果（表2）表明该方法的精密度良好。
3.3重复性考察按“2.4.1”项下方法制备供试品（12022231）6份，，按“2.1和2.2”条件进样分析，测得此批号中牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙平均含量分别为7.40，635.40，32.11，137.20 μg/mL。RSD值分别为1.53，2.10，1.98，2.11%，结果（表2）表明该方法的重复性良好。
3.4稳定性实验取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定，测得牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙峰面积的RSD值分别为3.97，3.63，3.93，4.24%。结果（表2）表明供试品溶液在24h内稳定。
3.5加样回收率实验精密吸取已知浓度的供试品溶液9等份，每3份为一组，分别精密加入高、中、低3个浓度的混合标准品溶液后，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液进行测定。计算各成分的回收率。本方法在加样3个浓度水平下，四种成分的加样回收率在95.00%～105%之间，RSD值均小于3%，能够满足双黄连口服液中四种有效成分的含量测定要求。结果见表3。
3.6样品含量测定取3个批号的双黄连口服液，按照“2.3.1”项下方法处理，平行制得各组待测样品溶液3份，进样分析，经计算得牛蒡子苷，连翘苷，灰毡毛忍冬皂苷乙，川续断皂苷乙的含量。具体见表4。
[HT64结论
4.1双黄连口服液的化学成分研究甚多，但多集中于运用HPLC[6]技术来检测并追踪化学成分，并对制剂中具较强紫外吸收且含量较高的成分进行定量分析，但对弱紫外吸收，含量较低且较难分离的成分含量测定分析时则相对困难。作者经过查阅文献发现，目前尚未见到报道用液-质串联的方法同时检测双黄连口服液中多种微量成分含量的报道，本实验首次使用LC-MS/MS联用技术，对双黄连口服液中多种微量成分进行了同时测定。方法简单、可靠、应用性强。
4.2本实验同时选用正离子模式测定4种成分的含量，且分子离子峰均为[M+Na]+。实验过程发现这四种物质[M+Na]+丰度强且稳定。MS/MS亦发现稳定且灵敏度高。
4.3本实验建立的液-质联用方法，可在短时间内快速分离检测双黄连口服液中牛蒡子苷、连翘苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙4种微量成分，该方法经考察，准确，快捷，重现性好，符合中药制剂的相关分析要求，可用于双黄连口服液的质量控制。此外，双黄连口服液的体内研究相对较少，随着液-质联用技术的不断普及，双黄连口服液物质基础研究包括体内研究也将越来越多。本实验为双黄连口服液的质量控制提供了依据，且为该制剂的临床前与临床药代动力学等相关研究提供了一定的参考。
4.4中药制剂定性、定量研究最初为单一指标性成分，随着以色谱质谱联用为代表（LC-MS/MS）的各种分析仪器、分离手段和计算机技术的迅速发展，目前，中药制剂化学成分定[LL]性、定量研究已经广泛采用多指标成分，为阐明中药的物质基础提供了重要手段[7]。由此可见，不断应用新理论、新方法和新技术将会有力的推动中药的现代研究，大大加快对中药物质基础与质量控制的研究。[KH*1D]
参考文献：
[1]Shang XF.，Pan H.，Li MX.，et al.Lonicera japonica Thunb.：Ethnopharmacology，phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine.J.Ethnopharmacol.2011，138：1-21.
[2]Zhou，W.，Tan，X.B.，Shan，J.J.，et al.Study on the Main Components Interaction from Flos Lonicerae and Fructus Forsythiae and Their Dissolution In Vitro and Intestinal Absorption in Rats.2014，Plos one.9，e109619.
[3]方颖，邹国安，刘焱文.连翘的化学成分[J].中国天然药物，2008，6（3）：235-236.
[4]娄红祥，郎伟君，吕木坚.金银花中水溶性化合物的分离与结构确定[J].中草药，1996，27（4）：195.
[5]陈昌祥，王薇薇，倪伟，等.金银花花蕾中的新三帖皂苷[J].云南植物研究，2000，22（2）：201-208.
[6]陈国宝，宋桂萍，杨弃尘.HPLC法同时测定双黄连片中黄芩苷、绿原酸、连翘苷、连翘酯苷的含量[J].中国药房，2011，48：4594-4596.
[7]Wang XJ.，Zhang AH.，Yan GL.，et al.UHPLC-MS for the analytical characterization of traditional Chinese medicines[J].Trends Analyt.Chem.2014，63：180-187.