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【摘要】 目的：利用MTT法检测天然化合物对肿瘤细胞的杀伤作用，寻找有抗肿瘤潜力的先导化合物。方法：药物和细胞按所需浓度于96孔板中，恒温培养48 h，加入5μg/ml MTT溶液20μl/孔，4 h后吸弃100μl/孔上清液，加入MTT裂解液100μl/孔，孵育过夜，用酶标仪检测各孔吸光值，根据Reed and Menuch法计算IC50值。结果：在对人肝癌细胞株HepG2的毒性试验中，化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均略低于50%，而阳性对照药物DDP则有明显的抑制肿瘤活性。结论：化合物Qiu17，Qiu33，Qiu22有一定的的抗肿瘤活性作用性。
【关键词】 天然化合物； 抗肿瘤； MTT
肿瘤通常分为良性与恶性，恶性肿瘤，即为癌症，长久以来危及着人类的生命健康，病死率居各类疾病之首，占全球人类死亡总数的12%。目前对肿瘤疾病的治疗中，手术治疗和放射治疗占有很大比重。但由于肿瘤易出现扩散和转移，致使在治疗过程中束手无策。目前临床使用的放射疗法和药物治疗由于选择性较低，杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有着不同程度的杀伤作用，使机体免疫功能减退、白细胞下降、免疫球蛋白水平下降而影响免疫功能；药物治疗也存在着巨大的缺陷，大多抗肿瘤药物具有骨髓抑制、胃肠道反应、心肌毒性、神经系统毒性、肾毒性等全身性的毒副作用[1]。长期使用不仅给身体带来严重的不良反应，并且还将导致肿瘤细胞形成多药耐药性（MDR）。肿瘤细胞的耐药性是化疗失败的主要原因之一，成为药物治疗癌症的难题，因此研发新的更好的抗肿瘤药物是生物医学领域的重要课题。同时，随着科学技术、分子生物学、分子药理学的快速发展及各个学科领域的相互渗透，抗肿瘤药物的研究与开发抗肿瘤药物已进入一个崭新的时代[2]。
1 材料与方法
1.1 仪器 Bio-rad680酶标仪，Water Jacketed CO2 Incubator，ClassⅡBiological Safety Cabinets and Laminar Airflow Workstation，荧光倒置显微镜（Nikon），单道移液器、多道移液器，枪头，96孔板、冻存管，血球计数板（71103），Eppendorf样品管等。
1.2 细胞株 人肝癌细胞（HepG2细胞）（中科院上海细胞库）。
1.3 药物及试剂 化合物Qiu17，Qiu22，Qiu33（中科院昆明植物所植化实验室）；DDP（美国sigma）。改良型RPMI-1640培养基，胎牛血清，胰酶，MTT液、20%SDS-50%DMF，PBS缓冲液，冻存液等。
1.4 方法
1.4.1 HepG2细胞的复苏、传代 将冻存管取出迅速将其放入37.0 ℃的水浴锅中快速搅拌融化，取出消毒并于超净台，用移液器吸出细胞液1 ml于培养皿中，再用电动加样器加入9 ml培养液，逐渐稀释细胞液，并吹打均匀，放入37.0 ℃、5% CO2培养箱中培养并观察。待肿瘤细胞贴比率达80%～90%时取出已复苏细胞，吸尽上清，加入1 ml PBS进行润洗，吸尽PBS，加入1 ml胰酶进行消化，2～3 min后镜检原先贴壁的细胞逐渐变圆，立即吸尽胰酶加入5 ml含10%血清的完全培养液终止消化，吹打均匀后取1 ml于新培养皿中，加入9 ml培养液吹打均匀后培养，传代4次后取对数生长期的细胞进行实验。
1.4.2 细胞冻存 取对数期的细胞进行消化处理，吸弃胰酶，加入冻存液。贴壁细胞不需离心直接加入冻存液吹打均匀后用移液器取1 ml细胞液加入冻存小管；悬浮细胞需离心后用冻存液进行重悬再加入冻存管。
1.4.3 MTT法的细胞毒性试验
1.4.3.1 接种细胞 取出装有HepG2细胞的培养皿，吸弃培养液，PBS洗涤后加入胰酶进行消化。细胞消化后取培养液4 ml进行重悬。重悬吹打均匀后迅速取微量20μl于血球计数板上，于倒置显微镜上进行计数，计算出细胞悬液的浓度，并取量稀释至1×105个/ml。
用排枪取细胞液100μl/孔分别加入新的96孔板中，除边缘不加，第12列三个孔作为空白对照，只有培养液200μl/孔。另外三个空作为阴性对照只有细胞液100μl/孔和培养液100μl/孔。边缘的其余孔分别加入200μl/孔的PBS。细胞接种完后置于培养箱中8 h，使之贴壁完全。
1.4.3.2 配药 从-20℃的低温冰箱中取出事先用DMSO溶解的化合物，融化并稀释成所需浓度，吸入灭过菌的Eppendorf样品管中，并标记Qiu17，Qiu33，Qiu22，DDP。前三种化合物储存液与工作液的配比均为4∶496，DDP为72：378。分别将最高浓度的4种待测化合物用移液器转移至96孔板中除边缘的第11、6列中。每一种药设3个复孔，加药量145μl/孔，其余孔加入120μl/孔的培养液。5倍梯度稀释成5个浓度。Qiu17，Qiu33，Qiu22三药的浓度依次为0.064、0.32、1.6、8、40μM，DDP为0.16、0.8、4、20、100μg/ml。
1.4.3.3 加药、呈色、比色 用排枪从先前配好药的96孔板中分别取100μl药液于贴壁的培养板中，浓度从左往右一次升高，培养48 h，在培养结束前4 h加入MTT液20μl/孔。小心吸弃培养的上清液100μl/孔，再加入20%SDS-50%DMF于培养箱中培育7～8 h。紫色结晶充分溶解后取出，摇床上震摇10 min，选择波长595nm，在Bio-rad680酶标仪上测定各孔的光吸收值即OD值，记录结果。
2 结果
2.1 检测报告各孔OD值见表1。
2.2 四种药物对HepG2的凋亡作用见图1。化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均低于50%，有但没有较为明显的抗肿瘤的作用，而顺铂（DDP）有明显的抑制作用。
图1 四种药物对HepG2的凋亡作用
3 讨论
由检测报告的数据来看，每一种药物对细胞均有不同程度的杀伤作用，并且随着药物浓度的升高细胞存活率降低。但是化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均低于50%，有但没有明显的抗肿瘤的作用，而顺铂（DDP）有明显的抑制作用。通过计算得出IC50值为1.694μg/ml，此浓度在0.8～4 μg/ml的范围之内。IC50即半数抑制浓度，是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需要的药物浓度[3]。从表中可以看到，每一种药物的每一个浓度所对应的点的标准差都很小，说明实验的误差较小。DDP的图表中可以看到最高浓度的OD值偏高，理论上浓度越高其抑制率为更强，分析是由于边缘效应的影响，由于在培养48 h的过程中，加入MTT液和MTT裂解液后又培养了7～8 h后，边缘的溶液蒸发，颜色加深，导致OD值偏高，然而这并不影响实验结果。
总之，新的化合物的分离提取到体外实验即对肿瘤细胞进行细胞毒性试验研究的是药物筛选的初级阶段，大批量的药物经过初筛后，还需经过复筛，重现。药物研发及其筛选是一个循环的过程，不断发现新的具有抗肿瘤的化合物，进行深入研究，必将给癌症患者带来福音。
参考文献
[1] 甄永苏.抗肿瘤药物研究与开发[M].北京： 化学工业出版社现代生物技术与医药科技出版中心，2009：9.
[2] 韩闯，杨胜昌.高通量筛选技术及其应用EJ[J].生物技术通报，2007，22（2）：20.
[3] （英）R.I.弗雷谢尼著；章静波，徐存拴等译. 动物细胞培养：基本技术指南[M].北京：科学出版社，2009：20.
（收稿日期：2012-08-15） （本文编辑：车艳）
【关键词】 天然化合物； 抗肿瘤； MTT
肿瘤通常分为良性与恶性，恶性肿瘤，即为癌症，长久以来危及着人类的生命健康，病死率居各类疾病之首，占全球人类死亡总数的12%。目前对肿瘤疾病的治疗中，手术治疗和放射治疗占有很大比重。但由于肿瘤易出现扩散和转移，致使在治疗过程中束手无策。目前临床使用的放射疗法和药物治疗由于选择性较低，杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有着不同程度的杀伤作用，使机体免疫功能减退、白细胞下降、免疫球蛋白水平下降而影响免疫功能；药物治疗也存在着巨大的缺陷，大多抗肿瘤药物具有骨髓抑制、胃肠道反应、心肌毒性、神经系统毒性、肾毒性等全身性的毒副作用[1]。长期使用不仅给身体带来严重的不良反应，并且还将导致肿瘤细胞形成多药耐药性（MDR）。肿瘤细胞的耐药性是化疗失败的主要原因之一，成为药物治疗癌症的难题，因此研发新的更好的抗肿瘤药物是生物医学领域的重要课题。同时，随着科学技术、分子生物学、分子药理学的快速发展及各个学科领域的相互渗透，抗肿瘤药物的研究与开发抗肿瘤药物已进入一个崭新的时代[2]。
1 材料与方法
1.1 仪器 Bio-rad680酶标仪，Water Jacketed CO2 Incubator，ClassⅡBiological Safety Cabinets and Laminar Airflow Workstation，荧光倒置显微镜（Nikon），单道移液器、多道移液器，枪头，96孔板、冻存管，血球计数板（71103），Eppendorf样品管等。
1.2 细胞株 人肝癌细胞（HepG2细胞）（中科院上海细胞库）。
1.3 药物及试剂 化合物Qiu17，Qiu22，Qiu33（中科院昆明植物所植化实验室）；DDP（美国sigma）。改良型RPMI-1640培养基，胎牛血清，胰酶，MTT液、20%SDS-50%DMF，PBS缓冲液，冻存液等。
1.4 方法
1.4.1 HepG2细胞的复苏、传代 将冻存管取出迅速将其放入37.0 ℃的水浴锅中快速搅拌融化，取出消毒并于超净台，用移液器吸出细胞液1 ml于培养皿中，再用电动加样器加入9 ml培养液，逐渐稀释细胞液，并吹打均匀，放入37.0 ℃、5% CO2培养箱中培养并观察。待肿瘤细胞贴比率达80%～90%时取出已复苏细胞，吸尽上清，加入1 ml PBS进行润洗，吸尽PBS，加入1 ml胰酶进行消化，2～3 min后镜检原先贴壁的细胞逐渐变圆，立即吸尽胰酶加入5 ml含10%血清的完全培养液终止消化，吹打均匀后取1 ml于新培养皿中，加入9 ml培养液吹打均匀后培养，传代4次后取对数生长期的细胞进行实验。
1.4.2 细胞冻存 取对数期的细胞进行消化处理，吸弃胰酶，加入冻存液。贴壁细胞不需离心直接加入冻存液吹打均匀后用移液器取1 ml细胞液加入冻存小管；悬浮细胞需离心后用冻存液进行重悬再加入冻存管。
1.4.3 MTT法的细胞毒性试验
1.4.3.1 接种细胞 取出装有HepG2细胞的培养皿，吸弃培养液，PBS洗涤后加入胰酶进行消化。细胞消化后取培养液4 ml进行重悬。重悬吹打均匀后迅速取微量20μl于血球计数板上，于倒置显微镜上进行计数，计算出细胞悬液的浓度，并取量稀释至1×105个/ml。
用排枪取细胞液100μl/孔分别加入新的96孔板中，除边缘不加，第12列三个孔作为空白对照，只有培养液200μl/孔。另外三个空作为阴性对照只有细胞液100μl/孔和培养液100μl/孔。边缘的其余孔分别加入200μl/孔的PBS。细胞接种完后置于培养箱中8 h，使之贴壁完全。
1.4.3.2 配药 从-20℃的低温冰箱中取出事先用DMSO溶解的化合物，融化并稀释成所需浓度，吸入灭过菌的Eppendorf样品管中，并标记Qiu17，Qiu33，Qiu22，DDP。前三种化合物储存液与工作液的配比均为4∶496，DDP为72：378。分别将最高浓度的4种待测化合物用移液器转移至96孔板中除边缘的第11、6列中。每一种药设3个复孔，加药量145μl/孔，其余孔加入120μl/孔的培养液。5倍梯度稀释成5个浓度。Qiu17，Qiu33，Qiu22三药的浓度依次为0.064、0.32、1.6、8、40μM，DDP为0.16、0.8、4、20、100μg/ml。
1.4.3.3 加药、呈色、比色 用排枪从先前配好药的96孔板中分别取100μl药液于贴壁的培养板中，浓度从左往右一次升高，培养48 h，在培养结束前4 h加入MTT液20μl/孔。小心吸弃培养的上清液100μl/孔，再加入20%SDS-50%DMF于培养箱中培育7～8 h。紫色结晶充分溶解后取出，摇床上震摇10 min，选择波长595nm，在Bio-rad680酶标仪上测定各孔的光吸收值即OD值，记录结果。
2 结果
2.1 检测报告各孔OD值见表1。
2.2 四种药物对HepG2的凋亡作用见图1。化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均低于50%，有但没有较为明显的抗肿瘤的作用，而顺铂（DDP）有明显的抑制作用。
图1 四种药物对HepG2的凋亡作用
3 讨论
由检测报告的数据来看，每一种药物对细胞均有不同程度的杀伤作用，并且随着药物浓度的升高细胞存活率降低。但是化合物Qiu17、Qiu33、Qiu22对细胞的抑制率均低于50%，有但没有明显的抗肿瘤的作用，而顺铂（DDP）有明显的抑制作用。通过计算得出IC50值为1.694μg/ml，此浓度在0.8～4 μg/ml的范围之内。IC50即半数抑制浓度，是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需要的药物浓度[3]。从表中可以看到，每一种药物的每一个浓度所对应的点的标准差都很小，说明实验的误差较小。DDP的图表中可以看到最高浓度的OD值偏高，理论上浓度越高其抑制率为更强，分析是由于边缘效应的影响，由于在培养48 h的过程中，加入MTT液和MTT裂解液后又培养了7～8 h后，边缘的溶液蒸发，颜色加深，导致OD值偏高，然而这并不影响实验结果。
总之，新的化合物的分离提取到体外实验即对肿瘤细胞进行细胞毒性试验研究的是药物筛选的初级阶段，大批量的药物经过初筛后，还需经过复筛，重现。药物研发及其筛选是一个循环的过程，不断发现新的具有抗肿瘤的化合物，进行深入研究，必将给癌症患者带来福音。
参考文献
[1] 甄永苏.抗肿瘤药物研究与开发[M].北京： 化学工业出版社现代生物技术与医药科技出版中心，2009：9.
[2] 韩闯，杨胜昌.高通量筛选技术及其应用EJ[J].生物技术通报，2007，22（2）：20.
[3] （英）R.I.弗雷谢尼著；章静波，徐存拴等译. 动物细胞培养：基本技术指南[M].北京：科学出版社，2009：20.
（收稿日期：2012-08-15） （本文编辑：车艳）