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摘要：在实验室条件下研究3种内生真菌对连作花生土壤尖孢镰刀菌的拮抗作用。结果表明：拟茎点霉NJ4.1菌株、拟茎点霉B3菌株和角担子菌B6菌株对花生根腐病病原菌尖孢镰刀菌均有拮抗作用，其中拟茎点霉NJ4.1菌株对尖孢镰刀菌抑制作用明显，抑菌率为38.93%，与尖孢镰刀菌生态位重叠指数为1/3；拟茎点霉NJ4.1菌株生长过程中产生的挥发物对尖孢镰刀菌抑菌率为18.15%，擬茎点霉NJ4.1菌株发酵液对尖孢镰刀菌也有一定的抑制作用，但明显小于挥发物对尖孢镰刀菌的影响。
关键词：内生真菌；花生根腐病；尖孢镰刀菌；拮抗作用；生态位重叠指数
中图分类号： S435.652文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）12-0171-04
收稿日期：2015-10-27
基金项目：国家自然科学基金（编号：31370507）；江苏省教育厅产业化推进项目（编号：JHB2012-16）。
作者简介：刘贵友（1973—），男，江苏南京人，博士，副教授，研究方向为微生物转化和微生物生态学。E-mail：[email protected]。
通信作者：戴传超，博士，教授，研究方向为微生物生态学和土壤生态与修复。E-mail：[email protected]。
花生是世界上分布较广泛的作物，世界六大洲都有种植。花生是我国重要的油料、经济作物，2013年我国花生种植面积463万hm2，花生总产量1 697万t，因此可见，我国是世界上花生总产量和花生油总产量最大的国家[1]。近年来，我国大豆产业受到国外冲击，花生行业的稳定及可持续发展对食用油安全有着重要意义。因土地资源有限，产区相对集中，很多地方已经形成传统的优势花生种植产业，农民常常连片、大规模种植，有的甚至已连作10～20年，往往导致花生根腐病、白绢病等真菌病害加剧[2]，荚果产量下降，生产成本增加[3]。
花生根腐病俗称“鼠尾”、烂根，它是由包括尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）在内的镰刀菌属引起的。最新研究表明，随着花生连续种植，尖孢镰刀菌的相对丰度显著增加，连作花生根腐病发病率提高2倍[4]，是限制连作花生生产的关键因素。病原真菌侵染不仅引起花生减产，而且还会影响花生品质[5]。目前，克服病原真菌引起的花生减产、质量下降的方法主要是使用大量有机肥和药剂等，这不仅增加生产成本，还会引起环境污染，危害人体健康等。生物防治是一种对环境友好、对病害具有潜在应用价值的综合治理方法。
研究表明，一些来源于病害植株的根际微生物可以对病菌形成拮抗作用[6]。外源施加哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以诱导黄瓜发生防御反应，产生可降解病菌细胞壁的相关酶[7]，显著防治黄瓜枯萎病[8-9]。从花生根际土壤中筛选得到侧孢短芽孢杆菌，对峙试验表明，侧孢短芽孢杆菌对花生根腐病、白绢病、疮痂病、叶斑病等病原菌有显著的抑制作用，盆栽和田间试验表明，该菌对花生根腐病、白绢病等均有明显的防治效果[10]。
研究发现，植物内生真菌施加到土壤环境中不仅可以促进植物生长[11-13]，而且可以诱导植物幼苗提高防御能力[14-17]，减少病害发生[18]，但是内生真菌的抗病机制不是非常清楚。本研究主要探讨实验室条件下内生真菌与花生常见病害——根腐病病原菌之间的拮抗机制，以期为花生根腐病的生物防治提供一定理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株内生真菌：拟茎点霉属真菌（Phomopsis sp.）NJ4.1，分离自菊科茅苍术（Rhizoma areactylodis Lanceae）叶片[12]；角担子菌属真菌（Ceratobasidum stevensii）B6，分离自大戟科重阳木（Bischofia polycarpa）茎内皮；拟茎点霉属真菌（Phomopsis liquidambari）菌株B3，分离自大戟科重阳木茎内皮[19]。花生病原真菌：尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum，简称Fo）。供试菌株均为南京师范大学江苏省功能微生物与功能基因组学重点实验室保藏菌株。
1.1.2培养基PDA培养基：马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，加水至1 L；PDB培养液：配方（不加琼脂）与PDA相同；单一碳/氮源培养基[20]：碳/氮源10 mmol/L，琼脂15 g，加水至1 L。内生真菌发酵液培养基：无菌发酵液10 mL，PDA培养基90 mL。
1.2内生真菌与病原菌平板对峙培养[21]
内生真菌和花生病原菌分别接入PDB培养液中，28 ℃、180 r/min振荡培养4 d。转接至PDA培养基平板，28 ℃培养5 d。在PDA培养基上活化的菌落边缘打取5 mm菌块，转接至新鲜PDA培养基平板上，内生真菌与病原菌之间距离 4 cm，28 ℃培养5 d，分别观察2种菌生长情况。在新鲜PDA培养基平板上接5 mm空白PDA培养基和5 mm病原菌菌块作为对照。按下式计算抑菌率：
抑菌率=（对照组菌落半径-试验组菌落半径）/对照组菌落半径×100%[22]。
1.3内生真菌与病原菌营养利用相似性
将内生真菌和花生病原菌分别接入PDB培养液中，28 ℃、180 r/min振荡培养4 d活化。将活化的内生真菌和病原菌分别接种到含唯一碳/氮源的琼脂平板上，本试验共有16种单一碳/氮源培养基（碳/氮源：果糖，葡萄糖，棉子糖，木糖，海藻糖，组氨酸，D-密二糖，丙氨酸，丝氨酸，精氨酸，蔗糖，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸）。用直径为5 mm的打孔器分别在母菌平板上打孔，得到均匀内生真菌和病原真菌，接种到每一种碳/氮源培养基的中心。对照组为接种在不含任何碳/氮源的琼脂平板上的内生真菌和病原真菌[23]。28 ℃培养5 d，观察内生真菌与病原真菌的生长情况。生态位重叠指数计算公式： [2]Li X G，Ding C F，Zhang T L，et al. Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing[J]. Soil Biology and Biochemistry，2014，72：11-18.
[3]Lemon R G，Lee T A，Black M，et al. Texas agricultural extension service fact sheet B-1514[J]. Texas Agricultural Extension Service，2001，48-55.
[4]Wang M Z，Chen X N. Obstacle and countermeasure of sustainable high yield for peanut in low-hilly red soil region[J]. Journal of Peanut Science，2005，34：17-22.
[5]王兴祥，张桃林，戴传超. 连作花生土壤障碍原因及消除技术研究进展[J]. 土壤，2010，42（4）：505-512.
[6]Zhao S，Liu D Y，Ling N，et al. Bio-organic fertilizer application significantly reduces the Fusarium oxysporum population and alters the composition of fungi communities of watermelon Fusarium wilt rhizosphere soil[J]. Biology and Fertility Soils，2014，50（5）：765-774.
[7]Blaya J，López-Mondéjar R，Lloret E，et al. Changes induced by Trichoderma harzianum in suppressive compost controlling Fusarium wilt[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology，2013，107（1）：112-119.
[8]Chen L H，Yang X M，Raza W，et al. Solid-state fermentation of agro-industrial wastes to produce bioorganic fertilizer for the biocontrol of Fusarium wilt of cucumber in continuously cropped soil[J]. Bioresource Technology，2011，102（4）：3900-3910.
[9]Zhang F G，Zhu Z，Yang X M，et al. Trichoderma harzianum T-E5 significantly affects cucumber root exudates and fungal community in the cucumber rhizosphere[J]. Applied Soil Ecology，2013，72：41-48.
[10]迟玉成，赵显民，许曼琳，等. 一株花生根际生防菌及其制备方法和应用：CN103756930A[P]. 2014-04-30.
[11]戴传超，谢慧，王兴祥，等. 间作药材与接种内生真菌对连作花生土壤微生物区系及产量的影响[J]. 生态学报，2010，30（8）：2105-2111.
[12]王宏伟，王兴祥，吕立新，等. 施加内生真菌对花生连作土壤微生物和酶活性的影响[J]. 应用生态学报，2012，23（10）：2693-2700.
[13]朱虹，王宏偉，杜威，等. 内生真菌重组漆酶rLACB3修复花生连作土壤[J]. 生态学杂志，2014，33（7）：1920-1927.
[14]陈晏，戴传超，王兴祥，等. 施加内生真菌拟茎点霉（Phomopsis sp.）对茅苍术凋落物降解及土壤降解酶活性的影响[J]. 土壤学报，2010，47（3）：537-544.
[15]Chen Y，Wang H W，Li L，et al. The potential application of the [JP3]endophyte Phomopsis liquidambari to the ecological remediation of long-term cropping soil[J]. Applied Soil Ecology，2013，67：20-26.
[16]谢星光，戴传超，苏春沦，等. 内生真菌对花生残茬腐解及土壤酚酸含量的影响[J]. 生态学报，2015，35（11）：3836-3845.
[17]Zhou J，Kang L，Wang H W，et al. Liquid laccase production by Phomopsis liquidambari B3 accelerated phenolic acids degradation in long-term cropping soil of peanut[J]. Acta Agriculturae Scandinavica，Section B-Soil and Plant Science，2014，64（8）：683-693. [18]Dai C C，Chen Y，Wang X X，et al. Effects of intercropping of peanut with the medicinal plant Atractylodes lancea on soil microecology and peanut yield in subtropical China[J]. Agroforestry Systems，2013，87（2）：417-426.
[19]戴传超，余伯阳，赵玉婷，等. 大戟科4 种植物内生真菌分离与抑菌研究[J]. 南京林业大学学报：自然科学版，2006，30（1）：70-83.
[20]李忠，金道超，邹晓，等. 蝉拟青霉菌丝对不同碳氮源利用的研究[J]. 安徽农业科学，2007，35（18）：5517-5518.
[21]江淑平，王志勇. 内生真菌感染对高羊茅褐斑病抗性的研究[J]. 安徽农业科学，2006，34（17）：4345-4346.
[22]邹勇，牛永春. 瓜类植物内生真菌对3种土传病菌的拮抗作用研究[J]. 安徽农业科学，2013，41（23）：9585-9588.
[23]Ludue？a，L M，Taurian T，Tonelli M L，et al. Biocontrol bacterial communities associated with diseased peanut （Arachis hypogaea L.） plants[J]. European Journal of Soil Biology，2012，53：48-55.
[24]Wilson M，Lindow S E. Coexistence among epiphytic bacterial populations mediated through nutritional resource partitioning[J]. Applied Environmental Microbiology，1994，60（12）：4468-4477.
[25]Gunatilaka A A L. Natural products from plant-associated microorganisms：distribution，structural diversity，bioactivity，and implications of their occurrence[J]. Journal of Natural Products，2006，69（3）：509-526.
[26]Zhou J Y，Zhao X Y，Dai C C. Antagonistic mechanisms of endophytic Pseudomonas fluorescens against Athelia rolfsii[J]. Journal of Applied Microbiology，2014，117（4）：1144-1158.
[27]Zhang H R，Xiong Y C，Zhao H Y，et al. An antimicrobial compound from the endophytic fungus Phoma sp. isolated from the medicinal plant Taraxacum mongolicum[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2013，44（2）：177-181.
[28]Hussain H，John M，Al-Harrasi A，et al. Phytochemical investigation and antimicrobial activity of an endophytic fungus Phoma sp.[JP3][J]. Journal of King Saud University-Science，2015，27（1）：92-95.
[29]Li S，Hartman G L，Boykin D L. Aggressiveness of Phomopsis longicolla and other Phomopsis spp. on soybean[J]. Plant Disease，2010，94（8）：1035-1040.
[30]Li Y Y，Wang M Z，Huang Y J，et al. Secondary metabolites from Phomopsis sp. A123[J]. Mycology，2010，1（4）：254-261.
[31]紀明山，李博强，陈捷，等. 绿色木霉TR-8菌株对尖镰孢的拮抗机制[J]. 中国生物防治，2005，21（2）：104-108.
[32]葛慈斌，刘波，蓝江林，等. 生防菌JK-2对尖孢镰刀菌抑制特性的研究[J]. 福建农业学报，2009，24（1）：29-34.
关键词：内生真菌；花生根腐病；尖孢镰刀菌；拮抗作用；生态位重叠指数
中图分类号： S435.652文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）12-0171-04
收稿日期：2015-10-27
基金项目：国家自然科学基金（编号：31370507）；江苏省教育厅产业化推进项目（编号：JHB2012-16）。
作者简介：刘贵友（1973—），男，江苏南京人，博士，副教授，研究方向为微生物转化和微生物生态学。E-mail：[email protected]。
通信作者：戴传超，博士，教授，研究方向为微生物生态学和土壤生态与修复。E-mail：[email protected]。
花生是世界上分布较广泛的作物，世界六大洲都有种植。花生是我国重要的油料、经济作物，2013年我国花生种植面积463万hm2，花生总产量1 697万t，因此可见，我国是世界上花生总产量和花生油总产量最大的国家[1]。近年来，我国大豆产业受到国外冲击，花生行业的稳定及可持续发展对食用油安全有着重要意义。因土地资源有限，产区相对集中，很多地方已经形成传统的优势花生种植产业，农民常常连片、大规模种植，有的甚至已连作10～20年，往往导致花生根腐病、白绢病等真菌病害加剧[2]，荚果产量下降，生产成本增加[3]。
花生根腐病俗称“鼠尾”、烂根，它是由包括尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）在内的镰刀菌属引起的。最新研究表明，随着花生连续种植，尖孢镰刀菌的相对丰度显著增加，连作花生根腐病发病率提高2倍[4]，是限制连作花生生产的关键因素。病原真菌侵染不仅引起花生减产，而且还会影响花生品质[5]。目前，克服病原真菌引起的花生减产、质量下降的方法主要是使用大量有机肥和药剂等，这不仅增加生产成本，还会引起环境污染，危害人体健康等。生物防治是一种对环境友好、对病害具有潜在应用价值的综合治理方法。
研究表明，一些来源于病害植株的根际微生物可以对病菌形成拮抗作用[6]。外源施加哈茨木霉（Trichoderma harzianum）可以诱导黄瓜发生防御反应，产生可降解病菌细胞壁的相关酶[7]，显著防治黄瓜枯萎病[8-9]。从花生根际土壤中筛选得到侧孢短芽孢杆菌，对峙试验表明，侧孢短芽孢杆菌对花生根腐病、白绢病、疮痂病、叶斑病等病原菌有显著的抑制作用，盆栽和田间试验表明，该菌对花生根腐病、白绢病等均有明显的防治效果[10]。
研究发现，植物内生真菌施加到土壤环境中不仅可以促进植物生长[11-13]，而且可以诱导植物幼苗提高防御能力[14-17]，减少病害发生[18]，但是内生真菌的抗病机制不是非常清楚。本研究主要探讨实验室条件下内生真菌与花生常见病害——根腐病病原菌之间的拮抗机制，以期为花生根腐病的生物防治提供一定理论依据。
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1.1.2培养基PDA培养基：马铃薯200 g，琼脂15 g，葡萄糖20 g，加水至1 L；PDB培养液：配方（不加琼脂）与PDA相同；单一碳/氮源培养基[20]：碳/氮源10 mmol/L，琼脂15 g，加水至1 L。内生真菌发酵液培养基：无菌发酵液10 mL，PDA培养基90 mL。
1.2内生真菌与病原菌平板对峙培养[21]
内生真菌和花生病原菌分别接入PDB培养液中，28 ℃、180 r/min振荡培养4 d。转接至PDA培养基平板，28 ℃培养5 d。在PDA培养基上活化的菌落边缘打取5 mm菌块，转接至新鲜PDA培养基平板上，内生真菌与病原菌之间距离 4 cm，28 ℃培养5 d，分别观察2种菌生长情况。在新鲜PDA培养基平板上接5 mm空白PDA培养基和5 mm病原菌菌块作为对照。按下式计算抑菌率：
抑菌率=（对照组菌落半径-试验组菌落半径）/对照组菌落半径×100%[22]。
1.3内生真菌与病原菌营养利用相似性
将内生真菌和花生病原菌分别接入PDB培养液中，28 ℃、180 r/min振荡培养4 d活化。将活化的内生真菌和病原菌分别接种到含唯一碳/氮源的琼脂平板上，本试验共有16种单一碳/氮源培养基（碳/氮源：果糖，葡萄糖，棉子糖，木糖，海藻糖，组氨酸，D-密二糖，丙氨酸，丝氨酸，精氨酸，蔗糖，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸）。用直径为5 mm的打孔器分别在母菌平板上打孔，得到均匀内生真菌和病原真菌，接种到每一种碳/氮源培养基的中心。对照组为接种在不含任何碳/氮源的琼脂平板上的内生真菌和病原真菌[23]。28 ℃培养5 d，观察内生真菌与病原真菌的生长情况。生态位重叠指数计算公式： [2]Li X G，Ding C F，Zhang T L，et al. Fungal pathogen accumulation at the expense of plant-beneficial fungi as a consequence of consecutive peanut monoculturing[J]. Soil Biology and Biochemistry，2014，72：11-18.
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[16]谢星光，戴传超，苏春沦，等. 内生真菌对花生残茬腐解及土壤酚酸含量的影响[J]. 生态学报，2015，35（11）：3836-3845.
[17]Zhou J，Kang L，Wang H W，et al. Liquid laccase production by Phomopsis liquidambari B3 accelerated phenolic acids degradation in long-term cropping soil of peanut[J]. Acta Agriculturae Scandinavica，Section B-Soil and Plant Science，2014，64（8）：683-693. [18]Dai C C，Chen Y，Wang X X，et al. Effects of intercropping of peanut with the medicinal plant Atractylodes lancea on soil microecology and peanut yield in subtropical China[J]. Agroforestry Systems，2013，87（2）：417-426.
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[20]李忠，金道超，邹晓，等. 蝉拟青霉菌丝对不同碳氮源利用的研究[J]. 安徽农业科学，2007，35（18）：5517-5518.
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[22]邹勇，牛永春. 瓜类植物内生真菌对3种土传病菌的拮抗作用研究[J]. 安徽农业科学，2013，41（23）：9585-9588.
[23]Ludue？a，L M，Taurian T，Tonelli M L，et al. Biocontrol bacterial communities associated with diseased peanut （Arachis hypogaea L.） plants[J]. European Journal of Soil Biology，2012，53：48-55.
[24]Wilson M，Lindow S E. Coexistence among epiphytic bacterial populations mediated through nutritional resource partitioning[J]. Applied Environmental Microbiology，1994，60（12）：4468-4477.
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[27]Zhang H R，Xiong Y C，Zhao H Y，et al. An antimicrobial compound from the endophytic fungus Phoma sp. isolated from the medicinal plant Taraxacum mongolicum[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2013，44（2）：177-181.
[28]Hussain H，John M，Al-Harrasi A，et al. Phytochemical investigation and antimicrobial activity of an endophytic fungus Phoma sp.[JP3][J]. Journal of King Saud University-Science，2015，27（1）：92-95.
[29]Li S，Hartman G L，Boykin D L. Aggressiveness of Phomopsis longicolla and other Phomopsis spp. on soybean[J]. Plant Disease，2010，94（8）：1035-1040.
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[32]葛慈斌，刘波，蓝江林，等. 生防菌JK-2对尖孢镰刀菌抑制特性的研究[J]. 福建农业学报，2009，24（1）：29-34.