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【摘要】目的：探讨姜黄素对H22肝癌细胞表型的影响。方法：采用不同剂量的姜黄素处理H22肝癌细胞，流式细胞术检测细胞膜上钙网蛋白（CRT）表达；PI检测细胞死亡状态。结果：低剂量的姜黄素对H22肝癌细胞无毒性，但可诱导其细胞膜异位表达CRT。结论：姜黄素可诱导H22肝癌细胞表型调变。
【关键词】姜黄素；钙网蛋白；肺癌；表型调变
【中图分类号】R453 【文献标识码】B 【文章编号】2095—8439（2015）04—0042—02
姜黄素（Curcumin，Cur）来源于姜黄、郁金、莪术、菖蒲等中药的根茎，具有降血压、抗心肌缺血、抗凝、降血脂、抗肿瘤等多种作用_1]。近年研究表明，姜黄素可诱导多种肿瘤细胞凋亡_2]。但由于高浓度姜黄素虽然能够诱导肿瘤细胞凋亡，但其副作用较大，本文就低浓度Cur对肝癌细胞表型、活性的影响进行了研究。
1材料与方法
1.1细胞
H22细胞购自美国ATCC，并以完全1640（含5%胎牛血清）培养于本实验中。
1.2主要试剂
姜黄素（Sigma-Adrich，纯度≥95%），用二甲基亚砜（DMSO）溶解。兔抗鼠CRT、抗体（R&D Systems公司，美国）；兔IgGl同型对照抗体（BD公司，美国）。PI购于Sigma公司。
1.3
表型调变诱导
H22细胞37℃，5%CO2培养，培养瓶内细胞汇合成片后以0.25%胰蛋白酶消化，按1：1传代。6孔板内传代细胞80%汇合后，加入不同浓度的Cur，继续培养12、24、48h。
1.4流式细胞仪检测H22细胞表面CRT表达
将H22细胞用0.25%胰酶消化，1000 r/min离心4min，弃上清，PBS溶液洗涤细胞2次，然后将细胞离心（1000 r/min，4 min），PBS重悬至细胞密度为4 ×106个/ml，取25 μl（1×105个细胞）于10 ml EP管中，加10μl兔抗鼠CRT—FITC，4℃避光孵育30 mln。最后，将细胞离心（1000 r/min，4 min），弃上清，去除未结合的荧光抗体，PBS重悬细胞至300μl。将同源对照抗体以同样的方法标记细胞。美国BD公司FACSAria流式细胞仪检测。
1.5细胞死亡状态检测
流式分析CRT表达之前，加入PI，分析CRT表达与细胞死亡状态的有关系。试剂盒说明书操作，Annexin V FITC/PI双染检测细胞凋亡。
2结果
2.1Cur诱导H22细胞表面CRT表达
流式分析显示，UV照射可诱导H22肝癌细胞表面表达CRT（图1）。
2.2低剂量的Cur并不诱导H22细胞凋亡
为验证UV能否诱导H22细胞免疫原性凋亡，我们采用CRT—FITC/PI、及Annexin V FITC/PI双染的方法检测CRT表达与细胞死亡的关系及凋亡特征性性标志物PS与细胞死亡状态的关系。结果显示，CRT表达早于PS且细胞膜处于完整状态。
3讨论
我国是全球肝癌发病率最高的国家，肝癌为我国第二位恶性肿瘤致死病因。肝癌的治疗目前仍以手术为主，但60%—70%的患者在确诊时已处于肿瘤晚期，仅有20—35%的肝癌患者适合手术治疗，即使根治术后的患者复发率仍高达50%。放、化疗是姑息性治疗及辅助治疗的主要方法，但因其毒副作用常常使患者难以耐受，严重降低生活质量。近年来，随着肿瘤研究的不断深入，中医药因高效低毒的独特优势得到了众多学者的重视。
姜黄素是从草本植物姜黄中提取的酚类色素，多项研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗诱变及抗肿瘤等活性。目前已有文献报道姜黄素可抑制肺癌细胞增殖，诱导凋亡，然而高浓度的药物治疗不可避免具有一定的负作用，且如何激发机体本身抗肿瘤免疫反应是目前治疗肿瘤的新的发展方向。有研究表明，低浓度的传统化疗药物紫杉醇并不杀死肿瘤细胞，但可诱导肺癌细胞表型调变，增强细胞毒T细胞（CTL）、细胞因子活化的杀伤细胞（CIK）对肿瘤细胞的杀伤活性。因此本研究尝试低浓度的Cur能否诱导肺癌细胞表型调变。结果表明，低浓度的Cur可以上调A549细胞表面CRT表达，但并不杀死肿瘤细胞。我们的研究结果指出，通过Cur诱导肿瘤细胞表型调变，并结合肿瘤疫苗或CIK细胞将有助于肺癌的治疗。
综上所述，Cur具有诱导肺癌细胞表型的作用，可为肺癌治疗提供新的治疗策略。
【关键词】姜黄素；钙网蛋白；肺癌；表型调变
【中图分类号】R453 【文献标识码】B 【文章编号】2095—8439（2015）04—0042—02
姜黄素（Curcumin，Cur）来源于姜黄、郁金、莪术、菖蒲等中药的根茎，具有降血压、抗心肌缺血、抗凝、降血脂、抗肿瘤等多种作用_1]。近年研究表明，姜黄素可诱导多种肿瘤细胞凋亡_2]。但由于高浓度姜黄素虽然能够诱导肿瘤细胞凋亡，但其副作用较大，本文就低浓度Cur对肝癌细胞表型、活性的影响进行了研究。
1材料与方法
1.1细胞
H22细胞购自美国ATCC，并以完全1640（含5%胎牛血清）培养于本实验中。
1.2主要试剂
姜黄素（Sigma-Adrich，纯度≥95%），用二甲基亚砜（DMSO）溶解。兔抗鼠CRT、抗体（R&D Systems公司，美国）；兔IgGl同型对照抗体（BD公司，美国）。PI购于Sigma公司。
1.3
表型调变诱导
H22细胞37℃，5%CO2培养，培养瓶内细胞汇合成片后以0.25%胰蛋白酶消化，按1：1传代。6孔板内传代细胞80%汇合后，加入不同浓度的Cur，继续培养12、24、48h。
1.4流式细胞仪检测H22细胞表面CRT表达
将H22细胞用0.25%胰酶消化，1000 r/min离心4min，弃上清，PBS溶液洗涤细胞2次，然后将细胞离心（1000 r/min，4 min），PBS重悬至细胞密度为4 ×106个/ml，取25 μl（1×105个细胞）于10 ml EP管中，加10μl兔抗鼠CRT—FITC，4℃避光孵育30 mln。最后，将细胞离心（1000 r/min，4 min），弃上清，去除未结合的荧光抗体，PBS重悬细胞至300μl。将同源对照抗体以同样的方法标记细胞。美国BD公司FACSAria流式细胞仪检测。
1.5细胞死亡状态检测
流式分析CRT表达之前，加入PI，分析CRT表达与细胞死亡状态的有关系。试剂盒说明书操作，Annexin V FITC/PI双染检测细胞凋亡。
2结果
2.1Cur诱导H22细胞表面CRT表达
流式分析显示，UV照射可诱导H22肝癌细胞表面表达CRT（图1）。
2.2低剂量的Cur并不诱导H22细胞凋亡
为验证UV能否诱导H22细胞免疫原性凋亡，我们采用CRT—FITC/PI、及Annexin V FITC/PI双染的方法检测CRT表达与细胞死亡的关系及凋亡特征性性标志物PS与细胞死亡状态的关系。结果显示，CRT表达早于PS且细胞膜处于完整状态。
3讨论
我国是全球肝癌发病率最高的国家，肝癌为我国第二位恶性肿瘤致死病因。肝癌的治疗目前仍以手术为主，但60%—70%的患者在确诊时已处于肿瘤晚期，仅有20—35%的肝癌患者适合手术治疗，即使根治术后的患者复发率仍高达50%。放、化疗是姑息性治疗及辅助治疗的主要方法，但因其毒副作用常常使患者难以耐受，严重降低生活质量。近年来，随着肿瘤研究的不断深入，中医药因高效低毒的独特优势得到了众多学者的重视。
姜黄素是从草本植物姜黄中提取的酚类色素，多项研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗诱变及抗肿瘤等活性。目前已有文献报道姜黄素可抑制肺癌细胞增殖，诱导凋亡，然而高浓度的药物治疗不可避免具有一定的负作用，且如何激发机体本身抗肿瘤免疫反应是目前治疗肿瘤的新的发展方向。有研究表明，低浓度的传统化疗药物紫杉醇并不杀死肿瘤细胞，但可诱导肺癌细胞表型调变，增强细胞毒T细胞（CTL）、细胞因子活化的杀伤细胞（CIK）对肿瘤细胞的杀伤活性。因此本研究尝试低浓度的Cur能否诱导肺癌细胞表型调变。结果表明，低浓度的Cur可以上调A549细胞表面CRT表达，但并不杀死肿瘤细胞。我们的研究结果指出，通过Cur诱导肿瘤细胞表型调变，并结合肿瘤疫苗或CIK细胞将有助于肺癌的治疗。
综上所述，Cur具有诱导肺癌细胞表型的作用，可为肺癌治疗提供新的治疗策略。