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摘要 [目的] 探讨NiL1（ClO4）2和NiL3（ClO4）2对多刺裸腹蚤的毒性。[方法]利用不同浓度的NiL1（ClO4）2和NiL3（ClO4）2处理多刺裸腹蚤，测定其半数致死量，并分析其对环境的影响。[结果] NiL3（ClO4）2和NiL1（ClO4）2对多刺裸腹蚤的半数致死量（LD50）分别为8.625 和14.755 mg/L，说明NiL3（ClO4）2的毒性要大于NiL1（ClO4）2 。推测2种化合物本身带有的苯环和甲基基团可能对细胞毒性有一定的影响。[结论] 该研究为进一步研究大环类化合物污染对多刺裸腹蚤的生理生化影响提供基础资料，并为淡水水体质量评价和防治提供参考依据。
关键词 NiL1（ClO4）2；NiL3（ClO4）2；多刺裸腹蚤；细胞毒性
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03296-03
Abstract [Objective] The research aimed to study the toxicity of NiL1（ClO4）2 and NiL3（ClO4）2 on Moina macrocapa. [Method] Moina macrocapa was treated with different concentrations of NiL1（ClO4）2 and NiL3（ClO4）2 to determine the median lethal dose（LD50）. And their effects on environment were analyzed. [Result] The median lethal dose（LD50）of NiL3（ClO4）2 and NiL1（ClO4）2 to M. macrocapa were 8.625 and 14.755 mg/L respectively， which indicated that the toxicity of NiL3（ClO4）2 was higher than that of NiL1（ClO4）2. It was deduced that benzene ring and methyl groups in these two compounds might have some influences on cytotoxic effect. [Conclusion] The research provided basic materials for further study on the effects of macrocyclic compounds pollution on the physiological and biochemical indices of Moina macrocapa and provided reference basis for the evaluation and control of fresh water quality.
Key words NiL1（ClO4）2； NiL3（ClO4）2； Moina macrocapa； Toxicity
近年来在大环配合物的应用方面进行了大量有益的研究，如大环配合物的电化学性能、生物活性和催化性能等。以前主要对大环配合物催化苯酚羟基化和制备苯二酚进行了应用研究，研究发现十四环四氮杂大环配合物对苯酚的羟基化具有一定的催化作用，且具有一定的选择性，具有一定的应用前景。然而，作为苯酚羟基化反应的催化剂，因其可能随工厂污水直接排到自然水体或灌溉农田，可能会对水体中的生物产生毒性效应，因此有必要对其毒性进行检测，为防治工业废水的污染和保护水生生物的正常生长提供参考。目前对淡水水体污染检测大多集中在淡水生物，如大型水蚤（Daphina magna）[1-3]和斑马鱼（Brachydanio rerio）[3-5]作为成熟的环境检测指示生物已经在水质监测中得到了广泛应用。笔者在实验室条件下用多刺裸腹蚤（节肢动物门甲壳纲枝角亚目裸腹蚤科）[6]为实验动物，研究这2种化合物对水蚤的的毒性，以期为进一步研究大环类化合物污染对多刺裸腹蚤的生理生化影响提供基础资料，并为淡水水体质量评价和防治提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 多刺裸腹蚤的培养
蚤种由安徽大学生命科学院提供，经镜检鉴定为多刺裸腹蚤，然后驯化一段时间，使其适应试验条件。试验前将长势好的蚤用玻璃管吸出，分开喂养，选择健壮蚤进行繁殖，一般试验用蚤为出生4～24 h内同一母体的幼蚤。
1.2 化合物的合成方法
1.2.1 NiL1（ClO4）2的合成方法。将50 ml无水丙酮和2 g无水乙二胺加到250 ml烧瓶中，在搅拌下滴加70%的高氯酸4.77 g，放置即有白色细微晶体析出[7-8]。过滤后用丙酮洗涤，干燥后得到6 g产品，产率约70%，熔点135.1～137 ℃，与文献相同[9]，其反应方程式如图1所示。
1.2.2 NiL3（ClO4）2的合成方法。将等摩尔苯叉丙酮30 g和乙二胺12 g，溶于300 ml乙醚混合液中，加热搅拌回流1 h，过滤后得到淡黄色晶体。过滤后固体物用乙醚洗涤至白色，石油醚重结晶，得到白色片状晶体约18 g，产率约51%，熔点33.4～134.6 ℃。NiL3（ClO4）2的反应方程式见图2。
以上2种药品均是参考文献[9-11]的方法在实验室内合成，其他试剂均为市售分析纯。
1.3 溶剂配制
将合成待测化合物先配制成浓度较高的储备液，再根据试验设置浓度和试验溶液体积计算出应添加储备液的数量，用前按所需体积进行稀释。用蒸馏水配制了NiL3（ClO4）2和NiL1（ClO4）2试验母液，浓度分别为3.2和8.0 g/L。其中，稀释水为去离子水，各水质指标均符合国家水质标准。试验期间水温为22～25 ℃，同一试验组温差不超过±1 ℃[12]。 1.4 方法
1.4.1 预试验。分别用2种化合物进行预试验，以确定化合物的毒性范围。每组试验中每个容器内放养5只同龄水蚤作为1组，选用100、50、25、12.5、5 mg/L 5个浓度梯度，每个浓度同时设3个重复组和对照组。按照国家标准GB/T 1326691[1]和ISO法以心脏停止跳动为大型水蚤死亡终点，24和48 h后分别观察动物的死亡情况，计算出100%死亡浓度（绝对死亡浓度LD100）和无死亡浓度（最大耐受浓度LD0），然后根据预试验得出的浓度范围来确定正式试验所用的浓度[12]。
1.4.2 NiL3（ClO4）2的毒性试验。根据预试验结果设置5、10、20、40、80 mg/L 5个浓度梯度，每个浓度设置3个重复组和1个不添加化合物的空白对照组，置于24孔板内。从培养容器取同一水蚤的同龄幼蚤，将其先收集在小烧杯内，用以调试至试验温度的稀释水洗3次，每次5 min，以减少培养液带入试验溶液。然后，挑选个头健壮，大小差不多的幼蚤放入不同浓度组，每组5只，在转移幼蚤时不能使其离开水[12]。然后置于25 ℃的光照培养箱中（12 D∶12 L）[13]，24、48 h分别定时观察，并记录蚤的活动情况和存活数。
1.4.3 NiL1（ClO4）2的毒性试验。NiL1（ClO4）2的毒性试验方法与NiL3（ClO4）2的方法相同，同样设置5个试验组，浓度也依次为5、10、20、40、80 mg/L，每个浓度设3个重复组和1个不添加化合物的空白对照组，放入5个水蚤，24、48 h观察，分别记录蚤的活动情况和存活数。
3 小结
蚤类是海洋河流的初级消费者，是良好的天然饵料，在水生生态系统的食物链中起着十分重要的作用。同时，蚤类对许多水体污染物有高度的敏感性，一旦蚤类受到毒物的危害，毒物将在食物链中逐渐积累，进而危害到整个生态系统的安全，研究水蚤可以为蚤类急性毒性的测定方法提供参考依据，而且水蚤容易饲养，因此被广泛用于水体毒理试验[12]。该试验表明，当NiL3（ClO4）2的浓度达到5 mg/L，NiL1（ClO4）2的浓度为10 mg/L时水蚤开始部分死亡；当NiL3（ClO4）2浓度达到40 mg/L、NiL1（ClO4）2的浓度为80 mg/L时，多刺裸腹蚤全部死亡。
该研究结果表明NiL1（ClO4）2和NiL3（ClO4）2 2种化合物对多刺裸腹蚤的半数致死量（LD50）值分别为14.755和8.625 mg/L，且24 h与48 h的LD50值差异不显著，因此试验过程中可以以24 h为1个观察周期，多刺裸腹蚤的活动强度随着毒物的增加和毒物中暴露时间的延长（24 h内）而逐渐变弱，直至死亡；同时，NiL3（ClO4）2的毒性要比NiL1（ClO4）2的毒性大，其结构基团分析表明NiL1（ClO4）2的7、12位的4个甲基被NiL3（ClO4）2上的2个苯环基团取代，甲基是生物所需化合物的常见基团毒性较小，而苯环基团本身对生物具有较强的毒性作用，因此其毒性大小可能与这2种化合物的不同基团有关，即四氮杂冠醚金属配合物包含苯基基团时要比相应的甲基基团的生物学毒性大。
另外，已有研究表明多刺裸腹蚤的首次产幼时间不受杀虫剂马拉硫磷（Malathion）、二嗪农（Diazinon）和重金属的显著影响[6，9，11，13]，其繁殖周期一般为2～3 d，然而当水蚤放入2种化合物中时，水蚤无明显的繁殖现象，说明NiL1（ClO4）2和NiL3（ClO4）2 2种化合物对水蚤的繁殖有一定的影响。
因此，在合成四氮杂冠醚金属配合物类的催化剂时，在保证催化效率的同时要选择环境友好性的配体基团合成化合物。该试验结果表明，NiL3（ClO4）2的毒性要比NiL1（ClO4）2的毒性大，苯环基团本身的毒性可能要大于甲基的毒性；同时，2种化合物对水蚤的繁殖有一定抑制作用。
安徽农业科学 2014年
参考文献
[1] 国家环境保护总局.GB/T 13266-91，水质物质对蚤类（大型蚤）急性毒性测定方法[S].北京：中国标准出版社，1992.
[2] TAN Y J，LI S N，WU X M.Chronic toxicity of several insecticides to Daphnia magna[J].Chinese Journal of Pesticide Science，2004，6（3）：62-66.
[3] DING Z H，YANG Y，JIN H J.Acute toxicity and bioconcentration factor of three pesticides on Brachydanio rerio[J].Chinese Journal of Applied Ecology，2004，15（5）：888-890.
[4] LI L，GUO D H，ZHU X M.Study on acute toxicity of triazophos and Acephate on Copepods[J].Journal of Xiamen University（Natural Science），2008，47（4）：602-606.
[5] 国家环境保护总局.GB/T 13267-91，水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法[S].北京：中国标准出版社，1992.
[6] WONG C K.Effects of diazinon on some population parameters of Moina macrocopa（Cladocera）[J].Water，Air，and Soil Pollution，1997，94（3/4）：393-399. [7] SONG J M，NI X M，ZHANG D G，et al.Fabrication and photoluminescence properties of hexagonal MoO3 rods[J].Solid State Sciences，2006，8（10）：1164-1167.
[8] CHEN Y J，ZHAO Y S，JING T S，et al.Joint toxicity test of cadmium and hydroxybenzene to Moina Marrocopa[J].Chongqing Environmental Science，2003，10（25）：10-11.
[9] WONG C K.Effects of chromium，copper，nickel，and zinc on longevity and reproduction of the cladoceran Moina macrocopa[J].Bull Environ Contam Toxicol，1993，50（5）：633-639.
[10] MULLER H G.Experiences with test system using Daphnia magna Ecotoxicol Enviro[J].Safety，1980，4：21.
[11] WONG C K，CHU K H，SHUM F F.Acute and chronic toxicity of malathion to the freshwater chdoceran Moina macropa[J].Water，Air，and Soil Pollution，1995，84 （3/4）：399-405.
[12] DU N S.China common freshwater Cladocera controlled Sofa[M].Beijing，China：Science Press，1973.
[13] YANG D Q，XI Y L，YAO S，et al.Efect of pBHC on the life table demography of cladoceran Moina macrocopa[J].Chinese Journal of Zoology，2007，42（5）：157-160.
[14] AN S L，MO Y X，OU C Q.Probit analysis with SPSS 10.0 software[J].Journal of First Military Medical University，2002，11：1019-1021.
关键词 NiL1（ClO4）2；NiL3（ClO4）2；多刺裸腹蚤；细胞毒性
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03296-03
Abstract [Objective] The research aimed to study the toxicity of NiL1（ClO4）2 and NiL3（ClO4）2 on Moina macrocapa. [Method] Moina macrocapa was treated with different concentrations of NiL1（ClO4）2 and NiL3（ClO4）2 to determine the median lethal dose（LD50）. And their effects on environment were analyzed. [Result] The median lethal dose（LD50）of NiL3（ClO4）2 and NiL1（ClO4）2 to M. macrocapa were 8.625 and 14.755 mg/L respectively， which indicated that the toxicity of NiL3（ClO4）2 was higher than that of NiL1（ClO4）2. It was deduced that benzene ring and methyl groups in these two compounds might have some influences on cytotoxic effect. [Conclusion] The research provided basic materials for further study on the effects of macrocyclic compounds pollution on the physiological and biochemical indices of Moina macrocapa and provided reference basis for the evaluation and control of fresh water quality.
Key words NiL1（ClO4）2； NiL3（ClO4）2； Moina macrocapa； Toxicity
近年来在大环配合物的应用方面进行了大量有益的研究，如大环配合物的电化学性能、生物活性和催化性能等。以前主要对大环配合物催化苯酚羟基化和制备苯二酚进行了应用研究，研究发现十四环四氮杂大环配合物对苯酚的羟基化具有一定的催化作用，且具有一定的选择性，具有一定的应用前景。然而，作为苯酚羟基化反应的催化剂，因其可能随工厂污水直接排到自然水体或灌溉农田，可能会对水体中的生物产生毒性效应，因此有必要对其毒性进行检测，为防治工业废水的污染和保护水生生物的正常生长提供参考。目前对淡水水体污染检测大多集中在淡水生物，如大型水蚤（Daphina magna）[1-3]和斑马鱼（Brachydanio rerio）[3-5]作为成熟的环境检测指示生物已经在水质监测中得到了广泛应用。笔者在实验室条件下用多刺裸腹蚤（节肢动物门甲壳纲枝角亚目裸腹蚤科）[6]为实验动物，研究这2种化合物对水蚤的的毒性，以期为进一步研究大环类化合物污染对多刺裸腹蚤的生理生化影响提供基础资料，并为淡水水体质量评价和防治提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 多刺裸腹蚤的培养
蚤种由安徽大学生命科学院提供，经镜检鉴定为多刺裸腹蚤，然后驯化一段时间，使其适应试验条件。试验前将长势好的蚤用玻璃管吸出，分开喂养，选择健壮蚤进行繁殖，一般试验用蚤为出生4～24 h内同一母体的幼蚤。
1.2 化合物的合成方法
1.2.1 NiL1（ClO4）2的合成方法。将50 ml无水丙酮和2 g无水乙二胺加到250 ml烧瓶中，在搅拌下滴加70%的高氯酸4.77 g，放置即有白色细微晶体析出[7-8]。过滤后用丙酮洗涤，干燥后得到6 g产品，产率约70%，熔点135.1～137 ℃，与文献相同[9]，其反应方程式如图1所示。
1.2.2 NiL3（ClO4）2的合成方法。将等摩尔苯叉丙酮30 g和乙二胺12 g，溶于300 ml乙醚混合液中，加热搅拌回流1 h，过滤后得到淡黄色晶体。过滤后固体物用乙醚洗涤至白色，石油醚重结晶，得到白色片状晶体约18 g，产率约51%，熔点33.4～134.6 ℃。NiL3（ClO4）2的反应方程式见图2。
以上2种药品均是参考文献[9-11]的方法在实验室内合成，其他试剂均为市售分析纯。
1.3 溶剂配制
将合成待测化合物先配制成浓度较高的储备液，再根据试验设置浓度和试验溶液体积计算出应添加储备液的数量，用前按所需体积进行稀释。用蒸馏水配制了NiL3（ClO4）2和NiL1（ClO4）2试验母液，浓度分别为3.2和8.0 g/L。其中，稀释水为去离子水，各水质指标均符合国家水质标准。试验期间水温为22～25 ℃，同一试验组温差不超过±1 ℃[12]。 1.4 方法
1.4.1 预试验。分别用2种化合物进行预试验，以确定化合物的毒性范围。每组试验中每个容器内放养5只同龄水蚤作为1组，选用100、50、25、12.5、5 mg/L 5个浓度梯度，每个浓度同时设3个重复组和对照组。按照国家标准GB/T 1326691[1]和ISO法以心脏停止跳动为大型水蚤死亡终点，24和48 h后分别观察动物的死亡情况，计算出100%死亡浓度（绝对死亡浓度LD100）和无死亡浓度（最大耐受浓度LD0），然后根据预试验得出的浓度范围来确定正式试验所用的浓度[12]。
1.4.2 NiL3（ClO4）2的毒性试验。根据预试验结果设置5、10、20、40、80 mg/L 5个浓度梯度，每个浓度设置3个重复组和1个不添加化合物的空白对照组，置于24孔板内。从培养容器取同一水蚤的同龄幼蚤，将其先收集在小烧杯内，用以调试至试验温度的稀释水洗3次，每次5 min，以减少培养液带入试验溶液。然后，挑选个头健壮，大小差不多的幼蚤放入不同浓度组，每组5只，在转移幼蚤时不能使其离开水[12]。然后置于25 ℃的光照培养箱中（12 D∶12 L）[13]，24、48 h分别定时观察，并记录蚤的活动情况和存活数。
1.4.3 NiL1（ClO4）2的毒性试验。NiL1（ClO4）2的毒性试验方法与NiL3（ClO4）2的方法相同，同样设置5个试验组，浓度也依次为5、10、20、40、80 mg/L，每个浓度设3个重复组和1个不添加化合物的空白对照组，放入5个水蚤，24、48 h观察，分别记录蚤的活动情况和存活数。
3 小结
蚤类是海洋河流的初级消费者，是良好的天然饵料，在水生生态系统的食物链中起着十分重要的作用。同时，蚤类对许多水体污染物有高度的敏感性，一旦蚤类受到毒物的危害，毒物将在食物链中逐渐积累，进而危害到整个生态系统的安全，研究水蚤可以为蚤类急性毒性的测定方法提供参考依据，而且水蚤容易饲养，因此被广泛用于水体毒理试验[12]。该试验表明，当NiL3（ClO4）2的浓度达到5 mg/L，NiL1（ClO4）2的浓度为10 mg/L时水蚤开始部分死亡；当NiL3（ClO4）2浓度达到40 mg/L、NiL1（ClO4）2的浓度为80 mg/L时，多刺裸腹蚤全部死亡。
该研究结果表明NiL1（ClO4）2和NiL3（ClO4）2 2种化合物对多刺裸腹蚤的半数致死量（LD50）值分别为14.755和8.625 mg/L，且24 h与48 h的LD50值差异不显著，因此试验过程中可以以24 h为1个观察周期，多刺裸腹蚤的活动强度随着毒物的增加和毒物中暴露时间的延长（24 h内）而逐渐变弱，直至死亡；同时，NiL3（ClO4）2的毒性要比NiL1（ClO4）2的毒性大，其结构基团分析表明NiL1（ClO4）2的7、12位的4个甲基被NiL3（ClO4）2上的2个苯环基团取代，甲基是生物所需化合物的常见基团毒性较小，而苯环基团本身对生物具有较强的毒性作用，因此其毒性大小可能与这2种化合物的不同基团有关，即四氮杂冠醚金属配合物包含苯基基团时要比相应的甲基基团的生物学毒性大。
另外，已有研究表明多刺裸腹蚤的首次产幼时间不受杀虫剂马拉硫磷（Malathion）、二嗪农（Diazinon）和重金属的显著影响[6，9，11，13]，其繁殖周期一般为2～3 d，然而当水蚤放入2种化合物中时，水蚤无明显的繁殖现象，说明NiL1（ClO4）2和NiL3（ClO4）2 2种化合物对水蚤的繁殖有一定的影响。
因此，在合成四氮杂冠醚金属配合物类的催化剂时，在保证催化效率的同时要选择环境友好性的配体基团合成化合物。该试验结果表明，NiL3（ClO4）2的毒性要比NiL1（ClO4）2的毒性大，苯环基团本身的毒性可能要大于甲基的毒性；同时，2种化合物对水蚤的繁殖有一定抑制作用。
安徽农业科学 2014年
参考文献
[1] 国家环境保护总局.GB/T 13266-91，水质物质对蚤类（大型蚤）急性毒性测定方法[S].北京：中国标准出版社，1992.
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[4] LI L，GUO D H，ZHU X M.Study on acute toxicity of triazophos and Acephate on Copepods[J].Journal of Xiamen University（Natural Science），2008，47（4）：602-606.
[5] 国家环境保护总局.GB/T 13267-91，水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法[S].北京：中国标准出版社，1992.
[6] WONG C K.Effects of diazinon on some population parameters of Moina macrocopa（Cladocera）[J].Water，Air，and Soil Pollution，1997，94（3/4）：393-399. [7] SONG J M，NI X M，ZHANG D G，et al.Fabrication and photoluminescence properties of hexagonal MoO3 rods[J].Solid State Sciences，2006，8（10）：1164-1167.
[8] CHEN Y J，ZHAO Y S，JING T S，et al.Joint toxicity test of cadmium and hydroxybenzene to Moina Marrocopa[J].Chongqing Environmental Science，2003，10（25）：10-11.
[9] WONG C K.Effects of chromium，copper，nickel，and zinc on longevity and reproduction of the cladoceran Moina macrocopa[J].Bull Environ Contam Toxicol，1993，50（5）：633-639.
[10] MULLER H G.Experiences with test system using Daphnia magna Ecotoxicol Enviro[J].Safety，1980，4：21.
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[12] DU N S.China common freshwater Cladocera controlled Sofa[M].Beijing，China：Science Press，1973.
[13] YANG D Q，XI Y L，YAO S，et al.Efect of pBHC on the life table demography of cladoceran Moina macrocopa[J].Chinese Journal of Zoology，2007，42（5）：157-160.
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