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摘 要：以安诺兰为试验材料，研究改良的CTAB法对安诺兰不同部位（老叶、嫩叶、气生根、花序、花苞）进行基因组DNA的提取，利用核酸蛋白测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。结果表明，安诺兰嫩叶的DNA提取从纯度和提取率均优于其他部位；花苞次之；花序DNA提取有少量的杂质污染， 老叶有少量RNA残留， 气生根则质量低。
关键词：安诺兰；DNA提取；ISSR
中图分类号 Q949.71+8.43 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）09-22-03
安诺兰（Anota hainanensis RolfeSchltr），又名海南钻喙兰，是兰科安诺兰属唯一的一个种，是海南特有种，为多年生常绿附生亚灌木状草本植物，属典型的热带附生兰。产于海南中南部低海拔丘陵地区，其性喜高温、通风、光照充足的气候环境，耐干旱，畏湿，畏寒冷，春节前后开花，是春节期间颇受欢迎的贺岁应节兰花品种。因具有很高的观赏和药用价值，其野生资源被掠夺性采伐，造成资源枯竭。目前对海南安诺兰的研究主要在其栽培[1]和组织培养[2]等方面，尚未见报道有关海南安诺兰种质资源收集、遗传多样性的研究。
ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，简单重复序列间扩增）是由Zietkiewicz等[3]人于1994年提出的一种新的分子标记技术，该技术具有快速、稳定性、多态性高、重复性好等优点[4]。ISSR标记通常为显性标记[5]，具有很好的稳定性、多态性[6]，而且无需预知研究对象的基因组序列而设计特异引物，操作简单，因此该技术已广泛应用于品种鉴定[7]、基因定位及遗传多样性分析中[8-9]。高质量的总DNA及稳定的PCR反应体系是获取可靠分子标记结果的前提[10]，为此，笔者拟研究获得高质量安诺兰基因组DNA的提取方法，并建立安诺兰ISSR反应体系，为该分子标记技术在海南安诺兰种质资源研究和遗传育种中的应用提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料 供试材料来自于海南省农业科学院园林花卉研究所兰圃的安诺兰，选取安诺兰不同部位—老叶、嫩叶、气生根、花序、花苞为材料。
1.2 DNA提取方法优化 经过改良的CTAB提取方法：（1）取材料1g加少量的PVP，在液氮中研磨至白色粉末状，将粉末迅速转入2.0mL的离心管中，放入冰盒备用。（2）每份样品加入1.5mL 60℃预热的DNA提取缓冲液，轻轻摇匀，放在冰上。（3）等所有提样品都研磨完以后，12 000rpm，4℃，离心5min，丢弃上清液。（4）加入约750mL预热60℃的裂解缓冲液，充分摇匀，65℃水浴45min，每隔20min摇1次，使其充分混匀。（5）加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）提取液摇匀至白色乳浊状，用10 000rpm，25℃，离心20min；将上清液转入新的2mL离心管中。（6）加入1/10体积3M乙酸钠（pH5.2）和0.6倍体积的预冷异丙醇，缓慢摇匀至有絮状沉淀物析出，常温下静置至少1h。（7）用6 000rpm，25℃，离心15min，倒掉上部液体，用75%乙醇洗3次，通风橱柜风干后加入200μL×TE溶解DNA。（8）加入10μg/μL的Rnase 3μL，37℃水浴1h。（9）加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提液，摇床轻轻摇30min。（10）用10 000rpm，25℃，离心15min，将上清液体转入新的2mL离心管。（11）加入等体积的氯仿：异戊醇（24∶1）抽提液再抽提一次。（12）用10 000rpm，25℃，离心15min，将上清液转入新的2mL离心管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的冰冻无水乙醇，慢慢摇匀至沉淀物析出，用枪头挑出沉淀，用75%乙醇洗3次，至无乙醇味道，在通风橱柜风干1～2h，DNA呈薄片透明状时加入50μL×TE溶解。轻轻弹，至样品完全溶解，放入-20℃冰箱保存备用。
1.3 DNA样品检测
1.3.1 紫外光谱检测 用超纯水稀释少量基因组DNA（稀释100倍），并用超纯水作为空白，利用紫外分光光度计检测OD260/OD280比值及DNA的浓度。DNA样品按100倍稀释后测定其在260nm和280nm处的紫外吸收值，OD260/OD280的比值表示DNA样品的纯度，可判断有无蛋白质、多糖、RNA等杂质（王关林等，2002）。若OD260/OD280值介于1.8～2.0，则表明DNA纯度较好，如果OD260/OD280小于1.8，表明有蛋白质污染；若OD260/OD280值大于2.0，表明DNA样品里面有RNA污染。然后根据OD比值计算出DNA的浓度和提取率。计算公式为：DNA浓度（μg/μL）=D260nm×100×稀释倍数/1 000；DNA提取率（μg/g）=DNA浓度（μg/uL）×提取的DNA体积（μL）/试验材料的用量（g）。DNA浓度（μg/mL）=OD260×样品稀释倍数×100。将检测后的DNA，稀释至30ng/μL，放入-20℃冰箱保存备用。
1.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测 取1μL稀释好的DNA样品，每个样品加入5μL10×loading buffer混匀，于0.8%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳40min，电泳结束后用凝胶成像分析系统（Tanon4100）观察DNA谱带，并拍照。
1.4 ISSR-PCR反应产物的检测 ISSR-PCR产物的检测：反应产物在含有0.5μg/mLGoldview染料的1.8%琼脂糖凝胶电泳中分离，用DNA Marker（2 000bp）作为相对分子量标记，以100V电压电泳60min，在紫外凝胶成像系统（Tanon4100）下观察并照相。
扩增程序参照Zietkiewicz等（1994），具体为：95℃预变性5min；94℃变性40s，引物在筛选后的最佳退火温度退火55s，72℃延伸1min30s，共计36个循环，循环结束后72℃延伸7min。PCR扩增在Biometra公司的T1PCR仪上进行扩增。 2 结果与分析
2.1 DNA提取结果与检测 经过改良的CTAB法提取的安诺兰基因组DNA呈白色絮状，通风橱柜自然吹干后为白色透明薄片状，加入3%β-巯基乙醇和2%PVP40，避免了多糖、多酚等次生物质的扰乱，有效防止了褐变。经过紫外分光光度计检测DNA的OD值，其OD值都在1.799～2.300，说明该法能较完全地去除蛋白质、酚类及多糖等杂质，对残留的氯仿、无机盐等也能去除干净，适合对安诺兰DNA基因组的提取。
用0.8%的琼脂糖胶检测提取的DNA的质量表明：用改良的CTAB法提取的安诺兰基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳上能呈现清楚的DNA光亮条带，不弥散，没有拖尾现象（图1）。
图1 安诺兰DNA0.8%琼脂糖凝胶电泳图
注：1～4为安诺兰花序；5～8为安诺兰嫩叶；9～12为安诺兰苞叶；13～16为安诺兰气生根；17～20为安诺兰老叶。
2.2 不同部位DNA的纯度和提取率 用紫外分光光度计检测各个处理的DNA的D260nm、D280nm值，分别计算出D260nm/D280nm、DNA浓度和提取率（表1）。结果表示，安诺兰嫩叶提取率和纯度都很高，D260nm/D280nm处于1.8～2.0，老叶的D260nm/D280nm大于2.0，表明样品还有RNA污染，须进一步除RNA。从提取率看嫩叶的提取率最高，其次是苞叶和花序，气生根和老叶纯度和提取率均很低。
3 结论与讨论
研究结果，安诺兰不同部位DNA的提取纯度都很高，表明安诺兰的5个不同部位都可以进行DNA的提取，但是DNA提取浓度和提取率各不相同，嫩叶的提取率最高，苞叶和花序次之，老叶和气生根提取率低。安诺兰的老叶由于提取率低，有杂质污染，且质地较硬，很难研磨，最好不选用进行DNA的提取。气生根提取率也不高，且根系损伤对植株生长影响较大，为不使整株受影响，根系提取DNA也不可行。苞叶和花序可作为安诺兰DNA提取的选择材料，但以嫩叶的提取率最高，且纯度好，提取过程中要注意RNA的污染。
本实验用改良的CTAB法适合安诺兰基因组DNA的提取，且DNA的质量好，纯度高，完全能满足安诺兰ISSR-PCR扩增的要求。
参考文献
[1]潘学峰，翁宝实，王小精.安诺兰无菌播种组织培养快繁技术研究[J].亚热带植物科学，2007，36（4）：27-29.
[2]潘梅，王景飞，黄赛.安诺兰的快速繁殖技术研究[J].热带林业，2005，33（2）：45-46.
[3]Zietkiewicz E，RafalskiA，Labuda D.Genome fingerprint ting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification [J].Genomics，1994，20：176-183.
[4]Shen j，Ding X，Liu D，et al，Intersimple sequence repeats（ISSR）molecular fingerpingting markers for anthen ticating populations of Dendrobium officinale KMURA et MIGO [J].Biol Phanm Bull，2006，29（3）：420-422.
[5]Tsumura Y，OhbaK，Strauss S H.Diversity and inheritance of intersimple sequence repeat polymorphism in Douglas（Pseudosuga menziessii）and sugi （Cryptan eria japonica）[J].Theor Appl Genet，1996，92：40-45.
[6]Fang D Q Roose M L.Indentification of closely related citrus cultivars with inter simple sequence repeat markers [J].Theor Appl Genet，1997，95：408-471.
[7]梁明山，曾宇，周翔，等.遗传标记及其在作物品种鉴定中的应用[J].植物学通报，2001，18（3）：257-265.
[8]晏慧君，付坚，李俊，等.云南普通野生稻遗传多样性和亲缘关系[J].植物学通报，2006，23（6）：670-676.
[9]谭祖猛，李云昌，胡琼，等.分子标记在油菜杂种优势利用中的研究进展[J].植物学通报，2008，25（2）：230-239.
[10]吕乐燕，季孔庶，黄焱.珍珠黄杨DNA的提取方法比较及ISSR反应体系的优化[J].分子植物育种，2007，5（1）：145-150.
（责编：张宏民）
关键词：安诺兰；DNA提取；ISSR
中图分类号 Q949.71+8.43 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）09-22-03
安诺兰（Anota hainanensis RolfeSchltr），又名海南钻喙兰，是兰科安诺兰属唯一的一个种，是海南特有种，为多年生常绿附生亚灌木状草本植物，属典型的热带附生兰。产于海南中南部低海拔丘陵地区，其性喜高温、通风、光照充足的气候环境，耐干旱，畏湿，畏寒冷，春节前后开花，是春节期间颇受欢迎的贺岁应节兰花品种。因具有很高的观赏和药用价值，其野生资源被掠夺性采伐，造成资源枯竭。目前对海南安诺兰的研究主要在其栽培[1]和组织培养[2]等方面，尚未见报道有关海南安诺兰种质资源收集、遗传多样性的研究。
ISSR（Inter Simple Sequence Repeat，简单重复序列间扩增）是由Zietkiewicz等[3]人于1994年提出的一种新的分子标记技术，该技术具有快速、稳定性、多态性高、重复性好等优点[4]。ISSR标记通常为显性标记[5]，具有很好的稳定性、多态性[6]，而且无需预知研究对象的基因组序列而设计特异引物，操作简单，因此该技术已广泛应用于品种鉴定[7]、基因定位及遗传多样性分析中[8-9]。高质量的总DNA及稳定的PCR反应体系是获取可靠分子标记结果的前提[10]，为此，笔者拟研究获得高质量安诺兰基因组DNA的提取方法，并建立安诺兰ISSR反应体系，为该分子标记技术在海南安诺兰种质资源研究和遗传育种中的应用提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 试验材料 供试材料来自于海南省农业科学院园林花卉研究所兰圃的安诺兰，选取安诺兰不同部位—老叶、嫩叶、气生根、花序、花苞为材料。
1.2 DNA提取方法优化 经过改良的CTAB提取方法：（1）取材料1g加少量的PVP，在液氮中研磨至白色粉末状，将粉末迅速转入2.0mL的离心管中，放入冰盒备用。（2）每份样品加入1.5mL 60℃预热的DNA提取缓冲液，轻轻摇匀，放在冰上。（3）等所有提样品都研磨完以后，12 000rpm，4℃，离心5min，丢弃上清液。（4）加入约750mL预热60℃的裂解缓冲液，充分摇匀，65℃水浴45min，每隔20min摇1次，使其充分混匀。（5）加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）提取液摇匀至白色乳浊状，用10 000rpm，25℃，离心20min；将上清液转入新的2mL离心管中。（6）加入1/10体积3M乙酸钠（pH5.2）和0.6倍体积的预冷异丙醇，缓慢摇匀至有絮状沉淀物析出，常温下静置至少1h。（7）用6 000rpm，25℃，离心15min，倒掉上部液体，用75%乙醇洗3次，通风橱柜风干后加入200μL×TE溶解DNA。（8）加入10μg/μL的Rnase 3μL，37℃水浴1h。（9）加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提液，摇床轻轻摇30min。（10）用10 000rpm，25℃，离心15min，将上清液体转入新的2mL离心管。（11）加入等体积的氯仿：异戊醇（24∶1）抽提液再抽提一次。（12）用10 000rpm，25℃，离心15min，将上清液转入新的2mL离心管，加入1/10体积的3M乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的冰冻无水乙醇，慢慢摇匀至沉淀物析出，用枪头挑出沉淀，用75%乙醇洗3次，至无乙醇味道，在通风橱柜风干1～2h，DNA呈薄片透明状时加入50μL×TE溶解。轻轻弹，至样品完全溶解，放入-20℃冰箱保存备用。
1.3 DNA样品检测
1.3.1 紫外光谱检测 用超纯水稀释少量基因组DNA（稀释100倍），并用超纯水作为空白，利用紫外分光光度计检测OD260/OD280比值及DNA的浓度。DNA样品按100倍稀释后测定其在260nm和280nm处的紫外吸收值，OD260/OD280的比值表示DNA样品的纯度，可判断有无蛋白质、多糖、RNA等杂质（王关林等，2002）。若OD260/OD280值介于1.8～2.0，则表明DNA纯度较好，如果OD260/OD280小于1.8，表明有蛋白质污染；若OD260/OD280值大于2.0，表明DNA样品里面有RNA污染。然后根据OD比值计算出DNA的浓度和提取率。计算公式为：DNA浓度（μg/μL）=D260nm×100×稀释倍数/1 000；DNA提取率（μg/g）=DNA浓度（μg/uL）×提取的DNA体积（μL）/试验材料的用量（g）。DNA浓度（μg/mL）=OD260×样品稀释倍数×100。将检测后的DNA，稀释至30ng/μL，放入-20℃冰箱保存备用。
1.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测 取1μL稀释好的DNA样品，每个样品加入5μL10×loading buffer混匀，于0.8%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳40min，电泳结束后用凝胶成像分析系统（Tanon4100）观察DNA谱带，并拍照。
1.4 ISSR-PCR反应产物的检测 ISSR-PCR产物的检测：反应产物在含有0.5μg/mLGoldview染料的1.8%琼脂糖凝胶电泳中分离，用DNA Marker（2 000bp）作为相对分子量标记，以100V电压电泳60min，在紫外凝胶成像系统（Tanon4100）下观察并照相。
扩增程序参照Zietkiewicz等（1994），具体为：95℃预变性5min；94℃变性40s，引物在筛选后的最佳退火温度退火55s，72℃延伸1min30s，共计36个循环，循环结束后72℃延伸7min。PCR扩增在Biometra公司的T1PCR仪上进行扩增。 2 结果与分析
2.1 DNA提取结果与检测 经过改良的CTAB法提取的安诺兰基因组DNA呈白色絮状，通风橱柜自然吹干后为白色透明薄片状，加入3%β-巯基乙醇和2%PVP40，避免了多糖、多酚等次生物质的扰乱，有效防止了褐变。经过紫外分光光度计检测DNA的OD值，其OD值都在1.799～2.300，说明该法能较完全地去除蛋白质、酚类及多糖等杂质，对残留的氯仿、无机盐等也能去除干净，适合对安诺兰DNA基因组的提取。
用0.8%的琼脂糖胶检测提取的DNA的质量表明：用改良的CTAB法提取的安诺兰基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳上能呈现清楚的DNA光亮条带，不弥散，没有拖尾现象（图1）。
图1 安诺兰DNA0.8%琼脂糖凝胶电泳图
注：1～4为安诺兰花序；5～8为安诺兰嫩叶；9～12为安诺兰苞叶；13～16为安诺兰气生根；17～20为安诺兰老叶。
2.2 不同部位DNA的纯度和提取率 用紫外分光光度计检测各个处理的DNA的D260nm、D280nm值，分别计算出D260nm/D280nm、DNA浓度和提取率（表1）。结果表示，安诺兰嫩叶提取率和纯度都很高，D260nm/D280nm处于1.8～2.0，老叶的D260nm/D280nm大于2.0，表明样品还有RNA污染，须进一步除RNA。从提取率看嫩叶的提取率最高，其次是苞叶和花序，气生根和老叶纯度和提取率均很低。
3 结论与讨论
研究结果，安诺兰不同部位DNA的提取纯度都很高，表明安诺兰的5个不同部位都可以进行DNA的提取，但是DNA提取浓度和提取率各不相同，嫩叶的提取率最高，苞叶和花序次之，老叶和气生根提取率低。安诺兰的老叶由于提取率低，有杂质污染，且质地较硬，很难研磨，最好不选用进行DNA的提取。气生根提取率也不高，且根系损伤对植株生长影响较大，为不使整株受影响，根系提取DNA也不可行。苞叶和花序可作为安诺兰DNA提取的选择材料，但以嫩叶的提取率最高，且纯度好，提取过程中要注意RNA的污染。
本实验用改良的CTAB法适合安诺兰基因组DNA的提取，且DNA的质量好，纯度高，完全能满足安诺兰ISSR-PCR扩增的要求。
参考文献
[1]潘学峰，翁宝实，王小精.安诺兰无菌播种组织培养快繁技术研究[J].亚热带植物科学，2007，36（4）：27-29.
[2]潘梅，王景飞，黄赛.安诺兰的快速繁殖技术研究[J].热带林业，2005，33（2）：45-46.
[3]Zietkiewicz E，RafalskiA，Labuda D.Genome fingerprint ting by simple sequence repeat （SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification [J].Genomics，1994，20：176-183.
[4]Shen j，Ding X，Liu D，et al，Intersimple sequence repeats（ISSR）molecular fingerpingting markers for anthen ticating populations of Dendrobium officinale KMURA et MIGO [J].Biol Phanm Bull，2006，29（3）：420-422.
[5]Tsumura Y，OhbaK，Strauss S H.Diversity and inheritance of intersimple sequence repeat polymorphism in Douglas（Pseudosuga menziessii）and sugi （Cryptan eria japonica）[J].Theor Appl Genet，1996，92：40-45.
[6]Fang D Q Roose M L.Indentification of closely related citrus cultivars with inter simple sequence repeat markers [J].Theor Appl Genet，1997，95：408-471.
[7]梁明山，曾宇，周翔，等.遗传标记及其在作物品种鉴定中的应用[J].植物学通报，2001，18（3）：257-265.
[8]晏慧君，付坚，李俊，等.云南普通野生稻遗传多样性和亲缘关系[J].植物学通报，2006，23（6）：670-676.
[9]谭祖猛，李云昌，胡琼，等.分子标记在油菜杂种优势利用中的研究进展[J].植物学通报，2008，25（2）：230-239.
[10]吕乐燕，季孔庶，黄焱.珍珠黄杨DNA的提取方法比较及ISSR反应体系的优化[J].分子植物育种，2007，5（1）：145-150.
（责编：张宏民）