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摘要 目的：考察淫羊藿苷在治療骨关节炎中的潜在价值，以及淫羊藿苷对核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体和半胱天冬酶-1（Caspase-1）的调控作用。方法：本研究通过脂多糖（LPS）诱导大鼠膝关节软骨细胞建立体外骨关节炎模型，通过碘乙酸单钠处理SD大鼠建立体内骨关节炎模型。通过乳酸脱氢酶漏出实验检测细胞毒性，通过MTT实验检测细胞活力。通过qRT-PCR检测NLRP3 mRNA的表达，通过Western Blotting检测NLRP3、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、Collagen Ⅱ、Caspase-1、ASC和GSDMD的蛋白表达。用免疫荧光法和免疫组化法检测软骨细胞和大鼠软骨中的NLRP3表达;番红O/固绿染色评价大鼠软骨病变。结果：与LPS组比较，LPS+ICA组LDH的漏出率、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD的表达水平明显降低，而Collagen Ⅱ明显升高（P<0.05）。与LPS+ICA+pcDNA3.1-NC组比较，LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3组的乳酸脱氢酶漏出率及NLRP3炎性小体相关蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与对照组比较，OA组大鼠软骨组织中NLRP3阳性细胞数量显著增加，而OA+ICA组的NLRP3阳性细胞数量明显降低（P<0.05）。与OA组比较，OA+ICA组的NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、Caspase-1、ASC和GSDMD的蛋白表达水平明显降低，而Collagen的蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：淫羊藿苷通过抑制NLRP3和Caspase-1信号转导来抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤和细胞焦亡，从而减轻大鼠骨关节炎。
关键词 骨关节炎;淫羊藿苷;细胞焦亡;NLRP3炎性小体;半胱天冬酶-1;软骨;脂多糖;乳酸脱氢酶
Abstract Objective：To investigate the potential value of icariin in the treatment of osteoarthritis and the regulatory effect of Icariin on nucleoside binding oligomerization domain like receptor protein 3（NLRP3） and caspase-1.Methods：In this study，lipopolysaccharide（LPS） was used to induce rat knee chondrocytes to establish an in vitro osteoarthritis model，and SD rats were treated with monosodium iodoacetate to establish an in vivo osteoarthritis model.The cytotoxicity was detected by the lactate dehydrogenase leakage test，and the cell viability was detected by the MTT test.The expression of NLRP3 mRNA was detected by qRT-PCR，and the protein expression of NLRP3，IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，collagen Ⅱ，Caspase-1，ASC and GSDMD was detected by Western Blotting.Immunofluorescence and immunohistochemical methods were used to detect the expression of NLRP3 in chondrocytes and rat cartilage.Safranin O/Fast Green staining evaluated cartilage lesions in rats.Results：Compared with LPS group，the LDH leakage rate and the expression levels of IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，NLRP3，Caspase-1，ASC，and GSDMD in LPS+ICA group were significantly reduced，while collagenⅡ was increased（P<0.05）.Compared with the LPS+ICA+pcDNA3.1-NC group，the lactate dehydrogenase leakage rate and the expression level of NLRP3 inflammasome-related protein in the LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3 group were significantly increased（P<0.05）.Compared with the control group，the number of NLRP3 positive cells in the cartilage tissue of the OA group increased significantly，while the number of NLRP3 positive cells in the OA+ICA group was significantly reduced（P<0.05）.Compared with the OA group，the protein expression levels of NRLP3，IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，Caspase-1，ASC and GSDMD in the OA+ICA group were significantly reduced，while the protein expression levels of collagen Ⅱ were significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Icariin inhibits lipopolysaccharide-induced chondrocyte damage and pyrolysis by inhibiting NLRP3 and Caspase-1 signaling，thereby reducing osteoarthritis in rats. Keywords Osteoarthritis; Icariin; Pyroptosis; NLRP3 inflammatory corpuscle; Caspase-1; Cartilage; Lipopolysaccharide; Lactate dehydrogenase
中图分类号：R284;R684文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.009
骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性退行性关节骨疾病，主要特征是关节僵硬和软骨退化。随着人口老龄化的加剧，OA的发病率逐年升高。目前，OA的药物治疗效果并不理想，因此需要开发更安全、耐受性更好的OA治疗药物[1]。软骨病变在OA的发展过程中扮演重要角色，包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、软骨基质损失和自噬。动物模型的研究表明，生长因子（如TGF-β和Wnt3a）以及信号分子（如β-catenin、Smad3和HIF-2α）均参与OA的发展[2-4]。此外，炎症和细胞外基质（ECM）的丢失被认为是OA软骨损伤的重要驱动因素[5]。了解这些因素的变化规律可能为OA提供有效的治疗方法。
细胞焦亡（Pyroptosis）是抑制依赖于半胱天冬酶-1（Caspase-1）且伴有炎症介质释放的程序性细胞死亡。细胞焦亡可以导致IL-1β和IL-18的产生以及巨噬细胞的裂解[6-7]。与细胞凋亡和简单细胞坏死不同，细胞焦亡过程是促炎性的，并由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体和Caspase-1信号通路介导。最近的研究表明，NLRP炎性小体NLRP1和NLRP3参与介导脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的成纤维样滑膜细胞的凋亡[8]。抑制这2种NLRP炎性小体导致凋亡相关细胞因子显著减少，表明NLRP1和NLRP3炎性小体可能在OA的发病中起重要作用。另一项研究表明，兔膝骨性关节炎模型关节软骨中NLRP3的水平升高，表明炎性小体参与了OA的发病过程[9]。但是，NLRP3介导的细胞焦亡在OA中的作用和潜在机制仍然未知。
淫羊藿是一种传统中草药，已被用于OA的治疗中。据报道，淫羊藿可以显著缓解OA并降低兔OA模型中尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、uPA受体（uPAR）和尿激酶型纤溶酶原激活物抑制剂的表达水平[10]。淫羊藿提取物淫羊藿苷（Icariin，ICA）具有抗骨质疏松和抗炎作用[11]。研究表明，淫羊藿苷通过抑制核因子κB信号通路的自噬而抑制OA炎症和软骨细胞凋亡[12-13]。此外，淫羊藿苷通过抑制IL-1β诱导的软骨肉瘤细胞中MAPK信号通路相关分子发挥软骨保护作用[14]。但是，淫羊藿苷缓解OA的分子机制及其与NLRP3炎性小体的关系尚未完全了解。本研究旨在考察淫羊藿苷在治疗OA方面的潜在作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠来自陕西省人民医院实验动物中心[SYXK（陕）2016-006]，7周龄，体质量为221～254 g。将大鼠饲养在标准实验室条件下：室温22～26 ℃、湿度45%～55%、光照12 h光暗循环，不限制饮食。本研究经过陕西省人民医院医学伦理委员会审核（伦理审批号：2019-0836），符合动物伦理原则。
1.1.2 试剂 淫羊藿苷（北京索莱宝科技有限公司，货号：I8760），胰蛋白酶（Invitrogen公司，美国，货号：90305），Ⅱ型胶原酶（Invitrogen公司，美国，货号：17101015），Dulbecco′s改良的Eagle培养基中（DMEM）（Invitrogen公司，美国，货号：A4192101），Lipofectamine 2000试剂盒（Invitrogen公司，美国，货号：11668019），Trizol试剂（Invitrogen公司，美国，货号：15596018），无血清Opti-MEM（Gibco公司，美国，货号：31985062），脂多糖（Sigma公司，美国，货号：Sigma-L2630），MTT试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：ST316），乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0016），双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0010S），Caspase-1活性检测试剂盒（ImmunoChemistry公司，美国，货号：19D40），多聚甲醛溶液（Santa Cruz公司，美国，货号：sc-281692），番红O/固绿染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，货号：SBJ-0276），Triton购自（Sigma Aldrich公司，德国，货号：303135），NLRP3（Abcam公司，英国，货号：ab263899），IL-1β（Abcam公司，英國，货号：ab234437），IL-18（Abcam公司，英国，货号：ab207323），MMP-1（Abcam公司，英国，货号：ab134184），MMP-13（Abcam公司，英国，货号：ab51072），collagend（Abcam公司，英国，货号：ab188570），Caspase-1（Abcam公司，英国，货号：ab207802），ASC（Abcam公司，英国，货号：ab151700），GSDMD（Abcam公司，英国，货号：ab219800），GAPDH（Abcam公司，英国，货号：ab8245），HRP标记的二抗IgG（Abcam公司，英国，货号：ab205719），二氨基联苯胺（DAB）（武汉艾美捷科技有限公司，货号：4800-30-07），RIPA缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司，货号：C1053-100），牛血清白蛋白（吉诺生物医药技术有限公司，货号：GNM-15270），高敏型ECL化学发光检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：E412-01），RT Master Mix（Takara公司，日本，货号：RR036A），SYBR Select Master Mix（赛默飞世尔科技有限公司，美国，货号：4472913）。 1.2 方法
1.2.1 软骨细胞的分离和培养 处死各组大鼠后分离膝关节并切取关节表面软骨。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，将软骨用2.0 g/L的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min。然后加入含有0.2%后型胶原酶的培养皿中在37 ℃培养，每隔1 h取上清通过筛网过滤软骨细胞，将得到的单细胞悬液以3 000×g离心10 min。然后将细胞置于完整的Dulbecco′s改良的Eagle培养基中（DMEM）在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。每隔2 d更换培养液，达到80%融合后进行传代培养。
1.2.2 软骨细胞转染 将全长NLRP3序列构建到pcDNA3.1中，并将重组的质粒命名为pcDNA3.1-NLRP3。将空载质粒用作阴性对照（pcDNA3.1-NC）。将细胞以3×105/孔的密度接种在6孔板中。当细胞融合度达到80%時，使用Lipofectamine 2000试剂盒用不同的质粒转染细胞。将4 μg质粒和10 μL Lipofectamine 2 000分别用200 μL无血清Opti-MEM稀释。将2种稀释液在室温下静置5 min并均匀混合。混合物放置20 min后添加到培养孔中，然后在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。6 h后更换完全培养基，48 h后收集细胞。
1.2.3 软骨细胞分组及脂多糖（LPS）诱导 将软骨细胞分为对照组、LPS组和LPS+淫羊藿苷组（LPS+ICA组）。对照组细胞不进行LPS处理，LPS组和LPS+ICA组细胞应用LPS处理。将LPS加入PBS缓冲液中配成10 μg/mL的LPS母液。然后将LPS加入细胞培养基中，浓度为20 ng/mL。将第1代大鼠软骨细胞消化制备细胞悬液，然后按照以1×105/mL接种于含有10%胎牛血清培养基（2 mL）的6孔板中，培养24 h后弃去培养基并用PBS洗涤，加入LPS培养基中培养24 h。LPS+ICA组细胞在LPS处理的基础上加用淫羊藿苷处理（100 μmol/L），用于后续研究。
1.2.4 细胞活力 将大鼠软骨细胞接种在96孔板中（1×104个细胞/孔），并用不同浓度的淫羊藿苷（0、1、10、20、50、100和200 μmol/L，纯度>98%）处理细胞24 h。然后，将20 μL MTT（5 mg/mL）添加到每个孔中，并在37 ℃下孵育4 h。除去上清液后，向每个孔中加入150 μL二甲基亚砜。然后摇动10 min，使用酶标仪检测570 nm处光密度（OD）值。
1.2.5 乳酸脱氢酶漏出率检测 通过细胞上清中的乳酸脱氢酶（LDH）漏出率来评价细胞毒性，LDH采用比色法通过乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒测定。
1.2.6 免疫荧光 在盖玻片上培养软骨细胞48 h，用4%多聚甲醛溶液固定，然后用含5%驴血清和0.1% Triton的PBS封闭溶液处理。随后，将样品与多克隆抗大鼠NLRP3抗体（1∶500）在4 ℃孵育过夜，然后用PBS洗涤3次并与抗大鼠IgG二抗（1∶200）和DAPI在室温下孵育1 h。通过共聚焦显微镜观察图像。
1.2.7 动物分组及OA大鼠模型 雄性SD大鼠适应性饲养1周后，将大鼠随机分为3组，对照组、OA组（OA组）和淫羊藿苷组（OA+ICA组），每组10只。通过注射碘乙酸钠（MIA）诱导大鼠OA模型。将MIA溶于0.9%氯化钠溶液中，终浓度为60 mg/mL。分别将50 μL MIA溶液注入OA组和淫羊藿苷组大鼠右膝关节腔内。对照组大鼠注射50 μL 0.9%氯化钠溶液。建模2周后，淫羊藿苷组大鼠每天按照50 mg/kg的剂量（0.5 mL）灌胃淫羊藿苷溶液，其他组灌胃等体积生理盐水。共治疗2周。然后处死大鼠，分离软骨组织。
1.2.8 番红O/固绿染色 将大鼠软骨下骨的软骨切块（1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm）并用中性甲醛溶液固定3 d，然后在30%的甲酸溶液中脱钙14 d，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋在并切成5 μm厚的切片。按照生产商说明，将切片用Weigert铁苏木素染色，然后用水漂洗并置于0.2%固绿溶液中1 min，在1%乙酸乙酯溶液中放置30 s，0.1%的番红O溶液孵育15 min。然后将样品脱水，透明，中性树胶封片。正常的软骨呈红色，背景呈绿色。
1.2.9 免疫组织化学 将大鼠软骨下骨的石蜡包埋组织切片在二甲苯中脱蜡并用梯度乙醇脱水。在柠檬酸钠缓冲液中回收抗原后，将切片与抗大鼠NLRP3抗体（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将切片与生物素化的IgG（1∶500）在37 ℃下孵育30 min，然后用PBS洗涤3次。将切片用二氨基联苯胺（DAB）进行着色3 min。从每个切片中随机选择5个典型视野进行观察并在光学显微镜下计数阳性染色细胞。
1.2.10 Western Blotting分析 使用含蛋白酶抑制剂的冰RIPA缓冲液裂解细胞。使用双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（BCA试剂盒）对蛋白质进行定量。用10% SDS-PAGE分离等量的蛋白质（20 μg），并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，将膜在5%牛血清白蛋白中室温封闭2 h。然后将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。一抗如下：NLRP3（1∶1 000）、IL-1β（1∶3 000）、IL-18（1∶3 000）、MMP-1（1∶1 000）、MMP-13（1∶1 000）、collagen如（1∶3 000）、Caspase-1（1∶2 000）、ASC（1∶2 000）、GSDMD（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）。用TBST洗涤3次后，将膜与HRP标记的相应山羊抗兔二抗IgG（1∶3 000）室温下孵育1 h。TBST洗涤3次后，用高敏型ECL化学发光检测试剂盒观察免疫反应蛋白。使用ImageJ软件量化每个条带的密度。 1.2.11 qRT-PCR 使用Trizol试剂从软骨细胞和软骨组织中提取总RNA，并用RT Master Mix反转录为cDNA。使用SYBR Select Master Mix在ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪上进行RT-PCR。反应程序如下：95 ℃变性30 s，60退火1 min，95 ℃延伸5 s。引物序列如下：NLRP3正向（5′-GTTGTGGGGAGAGGCAAACT-3′）和反向（5′-CACTGGACCTCGGACTGGAGTTA-3′），GAPDH正向（5′-CAACGACGGAGTGTTCAAACG-3′）和反向（5′-CCGACTCCAGACAGTACAT-3′）。使用GAPDH作为内部对照，通过2-△△Ct法计算基因相对表达。
1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，所有实验至少进行3次重复。计量资料用均值±标准差（±s）表示。通过单因素方差分析及Tukey检验进行组间差异比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脂多糖对软骨细胞中炎症介质和胶原蛋白的影响 与对照组细胞比较，LSP组大鼠软骨细胞中NRLP3的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。脂多糖孵育24 h后，与对照组比较，LPS组大鼠软骨细胞中NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1和MMP-13蛋白表达水平显著升高，而CollagenⅡ的表达明显降低（P<0.05）。见图1。
2.2 淫羊藿苷抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤 结果显示，淫羊藿苷以浓度依赖性的方式降低了大鼠软骨细胞活力（P<0.05）。乳酸脱氢酶（LDH）的漏出为细胞焦亡的主要指标。与对照组比较，LPS组的LDH漏出率明显升高;与LPS组比较，LPS+ICA组LDH的漏出率明显降低（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+ICA组的IL-1β、IL-18、MMP-1和MMP-13的蛋白表达水平明显降低，而CollagenⅡ明显升高（P<0.05）。见图2。
2.3 淫羊藿苷抑制脂多糖诱导的NLRP3和Caspase-1信号通路 与对照组比较，LPS组大鼠软骨细胞中NLRP3的表达水平明显升高（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+ICA组的NLRP3的表达水平明显降低（P<0.05）。与对照组比较，LPS组中Caspase-1、ASC和GSDMD的表达水平明显升高（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+ICA组的Caspase-1、ASC和GSDMD的表达水平明显降低（P<0.05）。见图3。
2.4 淫羊藿苷通过抑制NLRP3信号抑制大鼠软骨细胞焦亡 结果显示，转染了pcDNA3.1-NLRP3的大鼠软骨细胞中的NLPR3 mRNA表达水平显著高于阴性对照组（pcDNA3.1-NC）（P<0.05）。与LPS+ICA+pcDNA3.1-NC组比较，LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3组的乳酸脱氢酶漏出率明显升高（P<0.05），焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD表达水平明显升高（P<0.05）。见图4。
2.5 淫羊藿苷通过抑制NLRP3减轻大鼠OA损伤 番红O/固绿染色结果表明，与对照组比较，OA组中大鼠软骨破坏严重，番红O明显失染，OA+ICA组大鼠的软骨破坏程度较小。免疫组化染色结果显示，与对照组比较，OA组大鼠软骨组织中NLRP3阳性细胞数量显著增加;与OA组比较，OA+ICA组大鼠软骨组织中NLRP3阳性细胞数量明显减少（P<0.05）。见图5～6。
2.6 淫羊藿苷减轻OA大鼠中NLRP3介导的炎症反应和细胞焦亡并增加胶原蛋白的形成 结果表明，与OA组比较，OA+ICA组大鼠软骨中NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、Caspase-1、ASC和GSDMD的蛋白表达水平明显降低，而CollagenⅡ的蛋白表达水平明显升高（P<0.05），与体外软骨细胞实验的结果一致。见图7。
3 讨论
OA是一种进行性和恶化性的关节疾病，目前临床中所应用的药物如对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药等只能缓解疼痛，而无法治愈该病。炎症和细胞凋亡与OA的发展有关[15-16]。淫羊藿提取物淫羊藿苷（Icariin，ICA）具有抗氧化、抗神经炎和抗凋亡作用，在治疗如肿瘤、阿尔茨海默病、脑缺血、抑郁、糖尿病和帕金森病等多种疾病中疗效显著[17]。对于OA，研究显示，淫羊藿苷通过多种机制发挥抗骨质疏松和抗OA作用，包括抑制核因子κB信号通路及抑制MMP1、MMP3和MMP13的表达[18-21]。
NLRP3炎性小体已被证明通过刺激炎症介质和降解酶与各种关节炎疾病的发病机制相关[22]。最近的一项研究报道了NLRP1和NLRP3炎小体在成纤维样滑膜细胞炎症和凋亡中发挥重要作用，这表明NLRP1和NLPR3炎性小体可能参与OA的进展[8]。另外，NLRP3可能作为OA的潜在生物标志物，据报道，姜黄素或雌二醇抑制NLRP3炎性小体可下调炎症介质并阻止OA进展[23]。在本研究中，淫羊藿苷通过抑制NLRP3炎性小体信号转导减弱了脂多糖诱导的炎症和细胞焦亡，而NLRP3的过表达降低了淫羊藿苷的保护作用。这些结果充分证实了NLRP3炎性小体在OA中的病理学作用，并且抑制NLRP3的表达可实现对OA的治疗作用。
细胞焦亡是一种炎症激活引起的Caspase-1依赖性程序性细胞死亡，可导致细胞溶解和胞质内含物释放到细胞外环境[24]。Gasdermin D（GSDMD）是Gasdermin（GSDM）家族的成员，可被Caspase-1裂解并释放N末端结构域，其在质膜上寡聚形成用于释放如IL-1β和IL-18等底物的孔道[25]。Caspase-1介导的细胞焦亡在多种疾病的调节中起作用，例如多发性硬化、视网膜炎、神经系统疾病等。此外，Caspase-1的缺乏可降低慢性关节炎的关节病理改变[26]。与细胞凋亡和简单细胞坏死不同，细胞焦亡过程是促炎性的，并由NLRP3炎性小体介导。最近的研究表明，NLRP炎性小体NLRP1和NLRP3参与介导脂多糖诱导的成纤维样滑膜细胞的凋亡[8]。抑制这2种NLRP炎性小体导致凋亡相关细胞因子显著减少，表明NLRP1和NLRP3炎性小体可能在OA的发病机制中起重要作用[27]。另一项研究表明，兔膝骨性关节炎模型关节软骨中NLRP3的水平升高，表明炎性小体参与了OA的发病过程[9]。本研究进一步证明，脂多糖诱导了软骨细胞中NLRP3的表达，并促进了Caspase-1的激活。因此，淫羊藿苷可能通过干扰脂多糖介导的NLRP3和Caspase-1信號转导途径来缓解OA。 总之，NLRP3炎性小体在OA的发病中起关键作用。本研究表明，淫羊藿苷通过抑制NLRP3和Caspase-1信号转导来抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤和细胞焦亡，从而减轻大鼠OA。表明淫羊藿苷在OA治疗中具有较好的保护作用，有望成为新的OA治疗药物。
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（2020-07-09收稿 责任编辑：杨觉雄）
关键词 骨关节炎;淫羊藿苷;细胞焦亡;NLRP3炎性小体;半胱天冬酶-1;软骨;脂多糖;乳酸脱氢酶
Abstract Objective：To investigate the potential value of icariin in the treatment of osteoarthritis and the regulatory effect of Icariin on nucleoside binding oligomerization domain like receptor protein 3（NLRP3） and caspase-1.Methods：In this study，lipopolysaccharide（LPS） was used to induce rat knee chondrocytes to establish an in vitro osteoarthritis model，and SD rats were treated with monosodium iodoacetate to establish an in vivo osteoarthritis model.The cytotoxicity was detected by the lactate dehydrogenase leakage test，and the cell viability was detected by the MTT test.The expression of NLRP3 mRNA was detected by qRT-PCR，and the protein expression of NLRP3，IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，collagen Ⅱ，Caspase-1，ASC and GSDMD was detected by Western Blotting.Immunofluorescence and immunohistochemical methods were used to detect the expression of NLRP3 in chondrocytes and rat cartilage.Safranin O/Fast Green staining evaluated cartilage lesions in rats.Results：Compared with LPS group，the LDH leakage rate and the expression levels of IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，NLRP3，Caspase-1，ASC，and GSDMD in LPS+ICA group were significantly reduced，while collagenⅡ was increased（P<0.05）.Compared with the LPS+ICA+pcDNA3.1-NC group，the lactate dehydrogenase leakage rate and the expression level of NLRP3 inflammasome-related protein in the LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3 group were significantly increased（P<0.05）.Compared with the control group，the number of NLRP3 positive cells in the cartilage tissue of the OA group increased significantly，while the number of NLRP3 positive cells in the OA+ICA group was significantly reduced（P<0.05）.Compared with the OA group，the protein expression levels of NRLP3，IL-1β，IL-18，MMP-1，MMP-13，Caspase-1，ASC and GSDMD in the OA+ICA group were significantly reduced，while the protein expression levels of collagen Ⅱ were significantly increased（P<0.05）.Conclusion：Icariin inhibits lipopolysaccharide-induced chondrocyte damage and pyrolysis by inhibiting NLRP3 and Caspase-1 signaling，thereby reducing osteoarthritis in rats. Keywords Osteoarthritis; Icariin; Pyroptosis; NLRP3 inflammatory corpuscle; Caspase-1; Cartilage; Lipopolysaccharide; Lactate dehydrogenase
中图分类号：R284;R684文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.18.009
骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性退行性关节骨疾病，主要特征是关节僵硬和软骨退化。随着人口老龄化的加剧，OA的发病率逐年升高。目前，OA的药物治疗效果并不理想，因此需要开发更安全、耐受性更好的OA治疗药物[1]。软骨病变在OA的发展过程中扮演重要角色，包括氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、软骨基质损失和自噬。动物模型的研究表明，生长因子（如TGF-β和Wnt3a）以及信号分子（如β-catenin、Smad3和HIF-2α）均参与OA的发展[2-4]。此外，炎症和细胞外基质（ECM）的丢失被认为是OA软骨损伤的重要驱动因素[5]。了解这些因素的变化规律可能为OA提供有效的治疗方法。
细胞焦亡（Pyroptosis）是抑制依赖于半胱天冬酶-1（Caspase-1）且伴有炎症介质释放的程序性细胞死亡。细胞焦亡可以导致IL-1β和IL-18的产生以及巨噬细胞的裂解[6-7]。与细胞凋亡和简单细胞坏死不同，细胞焦亡过程是促炎性的，并由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体和Caspase-1信号通路介导。最近的研究表明，NLRP炎性小体NLRP1和NLRP3参与介导脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的成纤维样滑膜细胞的凋亡[8]。抑制这2种NLRP炎性小体导致凋亡相关细胞因子显著减少，表明NLRP1和NLRP3炎性小体可能在OA的发病中起重要作用。另一项研究表明，兔膝骨性关节炎模型关节软骨中NLRP3的水平升高，表明炎性小体参与了OA的发病过程[9]。但是，NLRP3介导的细胞焦亡在OA中的作用和潜在机制仍然未知。
淫羊藿是一种传统中草药，已被用于OA的治疗中。据报道，淫羊藿可以显著缓解OA并降低兔OA模型中尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、uPA受体（uPAR）和尿激酶型纤溶酶原激活物抑制剂的表达水平[10]。淫羊藿提取物淫羊藿苷（Icariin，ICA）具有抗骨质疏松和抗炎作用[11]。研究表明，淫羊藿苷通过抑制核因子κB信号通路的自噬而抑制OA炎症和软骨细胞凋亡[12-13]。此外，淫羊藿苷通过抑制IL-1β诱导的软骨肉瘤细胞中MAPK信号通路相关分子发挥软骨保护作用[14]。但是，淫羊藿苷缓解OA的分子机制及其与NLRP3炎性小体的关系尚未完全了解。本研究旨在考察淫羊藿苷在治疗OA方面的潜在作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠来自陕西省人民医院实验动物中心[SYXK（陕）2016-006]，7周龄，体质量为221～254 g。将大鼠饲养在标准实验室条件下：室温22～26 ℃、湿度45%～55%、光照12 h光暗循环，不限制饮食。本研究经过陕西省人民医院医学伦理委员会审核（伦理审批号：2019-0836），符合动物伦理原则。
1.1.2 试剂 淫羊藿苷（北京索莱宝科技有限公司，货号：I8760），胰蛋白酶（Invitrogen公司，美国，货号：90305），Ⅱ型胶原酶（Invitrogen公司，美国，货号：17101015），Dulbecco′s改良的Eagle培养基中（DMEM）（Invitrogen公司，美国，货号：A4192101），Lipofectamine 2000试剂盒（Invitrogen公司，美国，货号：11668019），Trizol试剂（Invitrogen公司，美国，货号：15596018），无血清Opti-MEM（Gibco公司，美国，货号：31985062），脂多糖（Sigma公司，美国，货号：Sigma-L2630），MTT试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：ST316），乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：C0016），双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0010S），Caspase-1活性检测试剂盒（ImmunoChemistry公司，美国，货号：19D40），多聚甲醛溶液（Santa Cruz公司，美国，货号：sc-281692），番红O/固绿染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司，货号：SBJ-0276），Triton购自（Sigma Aldrich公司，德国，货号：303135），NLRP3（Abcam公司，英国，货号：ab263899），IL-1β（Abcam公司，英國，货号：ab234437），IL-18（Abcam公司，英国，货号：ab207323），MMP-1（Abcam公司，英国，货号：ab134184），MMP-13（Abcam公司，英国，货号：ab51072），collagend（Abcam公司，英国，货号：ab188570），Caspase-1（Abcam公司，英国，货号：ab207802），ASC（Abcam公司，英国，货号：ab151700），GSDMD（Abcam公司，英国，货号：ab219800），GAPDH（Abcam公司，英国，货号：ab8245），HRP标记的二抗IgG（Abcam公司，英国，货号：ab205719），二氨基联苯胺（DAB）（武汉艾美捷科技有限公司，货号：4800-30-07），RIPA缓冲液（北京普利莱基因技术有限公司，货号：C1053-100），牛血清白蛋白（吉诺生物医药技术有限公司，货号：GNM-15270），高敏型ECL化学发光检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：E412-01），RT Master Mix（Takara公司，日本，货号：RR036A），SYBR Select Master Mix（赛默飞世尔科技有限公司，美国，货号：4472913）。 1.2 方法
1.2.1 软骨细胞的分离和培养 处死各组大鼠后分离膝关节并切取关节表面软骨。磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，将软骨用2.0 g/L的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min。然后加入含有0.2%后型胶原酶的培养皿中在37 ℃培养，每隔1 h取上清通过筛网过滤软骨细胞，将得到的单细胞悬液以3 000×g离心10 min。然后将细胞置于完整的Dulbecco′s改良的Eagle培养基中（DMEM）在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。每隔2 d更换培养液，达到80%融合后进行传代培养。
1.2.2 软骨细胞转染 将全长NLRP3序列构建到pcDNA3.1中，并将重组的质粒命名为pcDNA3.1-NLRP3。将空载质粒用作阴性对照（pcDNA3.1-NC）。将细胞以3×105/孔的密度接种在6孔板中。当细胞融合度达到80%時，使用Lipofectamine 2000试剂盒用不同的质粒转染细胞。将4 μg质粒和10 μL Lipofectamine 2 000分别用200 μL无血清Opti-MEM稀释。将2种稀释液在室温下静置5 min并均匀混合。混合物放置20 min后添加到培养孔中，然后在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。6 h后更换完全培养基，48 h后收集细胞。
1.2.3 软骨细胞分组及脂多糖（LPS）诱导 将软骨细胞分为对照组、LPS组和LPS+淫羊藿苷组（LPS+ICA组）。对照组细胞不进行LPS处理，LPS组和LPS+ICA组细胞应用LPS处理。将LPS加入PBS缓冲液中配成10 μg/mL的LPS母液。然后将LPS加入细胞培养基中，浓度为20 ng/mL。将第1代大鼠软骨细胞消化制备细胞悬液，然后按照以1×105/mL接种于含有10%胎牛血清培养基（2 mL）的6孔板中，培养24 h后弃去培养基并用PBS洗涤，加入LPS培养基中培养24 h。LPS+ICA组细胞在LPS处理的基础上加用淫羊藿苷处理（100 μmol/L），用于后续研究。
1.2.4 细胞活力 将大鼠软骨细胞接种在96孔板中（1×104个细胞/孔），并用不同浓度的淫羊藿苷（0、1、10、20、50、100和200 μmol/L，纯度>98%）处理细胞24 h。然后，将20 μL MTT（5 mg/mL）添加到每个孔中，并在37 ℃下孵育4 h。除去上清液后，向每个孔中加入150 μL二甲基亚砜。然后摇动10 min，使用酶标仪检测570 nm处光密度（OD）值。
1.2.5 乳酸脱氢酶漏出率检测 通过细胞上清中的乳酸脱氢酶（LDH）漏出率来评价细胞毒性，LDH采用比色法通过乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒测定。
1.2.6 免疫荧光 在盖玻片上培养软骨细胞48 h，用4%多聚甲醛溶液固定，然后用含5%驴血清和0.1% Triton的PBS封闭溶液处理。随后，将样品与多克隆抗大鼠NLRP3抗体（1∶500）在4 ℃孵育过夜，然后用PBS洗涤3次并与抗大鼠IgG二抗（1∶200）和DAPI在室温下孵育1 h。通过共聚焦显微镜观察图像。
1.2.7 动物分组及OA大鼠模型 雄性SD大鼠适应性饲养1周后，将大鼠随机分为3组，对照组、OA组（OA组）和淫羊藿苷组（OA+ICA组），每组10只。通过注射碘乙酸钠（MIA）诱导大鼠OA模型。将MIA溶于0.9%氯化钠溶液中，终浓度为60 mg/mL。分别将50 μL MIA溶液注入OA组和淫羊藿苷组大鼠右膝关节腔内。对照组大鼠注射50 μL 0.9%氯化钠溶液。建模2周后，淫羊藿苷组大鼠每天按照50 mg/kg的剂量（0.5 mL）灌胃淫羊藿苷溶液，其他组灌胃等体积生理盐水。共治疗2周。然后处死大鼠，分离软骨组织。
1.2.8 番红O/固绿染色 将大鼠软骨下骨的软骨切块（1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm）并用中性甲醛溶液固定3 d，然后在30%的甲酸溶液中脱钙14 d，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋在并切成5 μm厚的切片。按照生产商说明，将切片用Weigert铁苏木素染色，然后用水漂洗并置于0.2%固绿溶液中1 min，在1%乙酸乙酯溶液中放置30 s，0.1%的番红O溶液孵育15 min。然后将样品脱水，透明，中性树胶封片。正常的软骨呈红色，背景呈绿色。
1.2.9 免疫组织化学 将大鼠软骨下骨的石蜡包埋组织切片在二甲苯中脱蜡并用梯度乙醇脱水。在柠檬酸钠缓冲液中回收抗原后，将切片与抗大鼠NLRP3抗体（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜。用PBS洗涤3次后，将切片与生物素化的IgG（1∶500）在37 ℃下孵育30 min，然后用PBS洗涤3次。将切片用二氨基联苯胺（DAB）进行着色3 min。从每个切片中随机选择5个典型视野进行观察并在光学显微镜下计数阳性染色细胞。
1.2.10 Western Blotting分析 使用含蛋白酶抑制剂的冰RIPA缓冲液裂解细胞。使用双辛可宁酸蛋白质测定试剂盒（BCA试剂盒）对蛋白质进行定量。用10% SDS-PAGE分离等量的蛋白质（20 μg），并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，将膜在5%牛血清白蛋白中室温封闭2 h。然后将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。一抗如下：NLRP3（1∶1 000）、IL-1β（1∶3 000）、IL-18（1∶3 000）、MMP-1（1∶1 000）、MMP-13（1∶1 000）、collagen如（1∶3 000）、Caspase-1（1∶2 000）、ASC（1∶2 000）、GSDMD（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）。用TBST洗涤3次后，将膜与HRP标记的相应山羊抗兔二抗IgG（1∶3 000）室温下孵育1 h。TBST洗涤3次后，用高敏型ECL化学发光检测试剂盒观察免疫反应蛋白。使用ImageJ软件量化每个条带的密度。 1.2.11 qRT-PCR 使用Trizol试剂从软骨细胞和软骨组织中提取总RNA，并用RT Master Mix反转录为cDNA。使用SYBR Select Master Mix在ABI StepOnePlus实时荧光定量PCR仪上进行RT-PCR。反应程序如下：95 ℃变性30 s，60退火1 min，95 ℃延伸5 s。引物序列如下：NLRP3正向（5′-GTTGTGGGGAGAGGCAAACT-3′）和反向（5′-CACTGGACCTCGGACTGGAGTTA-3′），GAPDH正向（5′-CAACGACGGAGTGTTCAAACG-3′）和反向（5′-CCGACTCCAGACAGTACAT-3′）。使用GAPDH作为内部对照，通过2-△△Ct法计算基因相对表达。
1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，所有实验至少进行3次重复。计量资料用均值±标准差（±s）表示。通过单因素方差分析及Tukey检验进行组间差异比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 脂多糖对软骨细胞中炎症介质和胶原蛋白的影响 与对照组细胞比较，LSP组大鼠软骨细胞中NRLP3的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。脂多糖孵育24 h后，与对照组比较，LPS组大鼠软骨细胞中NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1和MMP-13蛋白表达水平显著升高，而CollagenⅡ的表达明显降低（P<0.05）。见图1。
2.2 淫羊藿苷抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤 结果显示，淫羊藿苷以浓度依赖性的方式降低了大鼠软骨细胞活力（P<0.05）。乳酸脱氢酶（LDH）的漏出为细胞焦亡的主要指标。与对照组比较，LPS组的LDH漏出率明显升高;与LPS组比较，LPS+ICA组LDH的漏出率明显降低（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+ICA组的IL-1β、IL-18、MMP-1和MMP-13的蛋白表达水平明显降低，而CollagenⅡ明显升高（P<0.05）。见图2。
2.3 淫羊藿苷抑制脂多糖诱导的NLRP3和Caspase-1信号通路 与对照组比较，LPS组大鼠软骨细胞中NLRP3的表达水平明显升高（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+ICA组的NLRP3的表达水平明显降低（P<0.05）。与对照组比较，LPS组中Caspase-1、ASC和GSDMD的表达水平明显升高（P<0.05）。与LPS组比较，LPS+ICA组的Caspase-1、ASC和GSDMD的表达水平明显降低（P<0.05）。见图3。
2.4 淫羊藿苷通过抑制NLRP3信号抑制大鼠软骨细胞焦亡 结果显示，转染了pcDNA3.1-NLRP3的大鼠软骨细胞中的NLPR3 mRNA表达水平显著高于阴性对照组（pcDNA3.1-NC）（P<0.05）。与LPS+ICA+pcDNA3.1-NC组比较，LPS+ICA+pcDNA3.1-NLRP3组的乳酸脱氢酶漏出率明显升高（P<0.05），焦亡相关蛋白NLRP3、Caspase-1、ASC和GSDMD表达水平明显升高（P<0.05）。见图4。
2.5 淫羊藿苷通过抑制NLRP3减轻大鼠OA损伤 番红O/固绿染色结果表明，与对照组比较，OA组中大鼠软骨破坏严重，番红O明显失染，OA+ICA组大鼠的软骨破坏程度较小。免疫组化染色结果显示，与对照组比较，OA组大鼠软骨组织中NLRP3阳性细胞数量显著增加;与OA组比较，OA+ICA组大鼠软骨组织中NLRP3阳性细胞数量明显减少（P<0.05）。见图5～6。
2.6 淫羊藿苷减轻OA大鼠中NLRP3介导的炎症反应和细胞焦亡并增加胶原蛋白的形成 结果表明，与OA组比较，OA+ICA组大鼠软骨中NRLP3、IL-1β、IL-18、MMP-1、MMP-13、Caspase-1、ASC和GSDMD的蛋白表达水平明显降低，而CollagenⅡ的蛋白表达水平明显升高（P<0.05），与体外软骨细胞实验的结果一致。见图7。
3 讨论
OA是一种进行性和恶化性的关节疾病，目前临床中所应用的药物如对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药等只能缓解疼痛，而无法治愈该病。炎症和细胞凋亡与OA的发展有关[15-16]。淫羊藿提取物淫羊藿苷（Icariin，ICA）具有抗氧化、抗神经炎和抗凋亡作用，在治疗如肿瘤、阿尔茨海默病、脑缺血、抑郁、糖尿病和帕金森病等多种疾病中疗效显著[17]。对于OA，研究显示，淫羊藿苷通过多种机制发挥抗骨质疏松和抗OA作用，包括抑制核因子κB信号通路及抑制MMP1、MMP3和MMP13的表达[18-21]。
NLRP3炎性小体已被证明通过刺激炎症介质和降解酶与各种关节炎疾病的发病机制相关[22]。最近的一项研究报道了NLRP1和NLRP3炎小体在成纤维样滑膜细胞炎症和凋亡中发挥重要作用，这表明NLRP1和NLPR3炎性小体可能参与OA的进展[8]。另外，NLRP3可能作为OA的潜在生物标志物，据报道，姜黄素或雌二醇抑制NLRP3炎性小体可下调炎症介质并阻止OA进展[23]。在本研究中，淫羊藿苷通过抑制NLRP3炎性小体信号转导减弱了脂多糖诱导的炎症和细胞焦亡，而NLRP3的过表达降低了淫羊藿苷的保护作用。这些结果充分证实了NLRP3炎性小体在OA中的病理学作用，并且抑制NLRP3的表达可实现对OA的治疗作用。
细胞焦亡是一种炎症激活引起的Caspase-1依赖性程序性细胞死亡，可导致细胞溶解和胞质内含物释放到细胞外环境[24]。Gasdermin D（GSDMD）是Gasdermin（GSDM）家族的成员，可被Caspase-1裂解并释放N末端结构域，其在质膜上寡聚形成用于释放如IL-1β和IL-18等底物的孔道[25]。Caspase-1介导的细胞焦亡在多种疾病的调节中起作用，例如多发性硬化、视网膜炎、神经系统疾病等。此外，Caspase-1的缺乏可降低慢性关节炎的关节病理改变[26]。与细胞凋亡和简单细胞坏死不同，细胞焦亡过程是促炎性的，并由NLRP3炎性小体介导。最近的研究表明，NLRP炎性小体NLRP1和NLRP3参与介导脂多糖诱导的成纤维样滑膜细胞的凋亡[8]。抑制这2种NLRP炎性小体导致凋亡相关细胞因子显著减少，表明NLRP1和NLRP3炎性小体可能在OA的发病机制中起重要作用[27]。另一项研究表明，兔膝骨性关节炎模型关节软骨中NLRP3的水平升高，表明炎性小体参与了OA的发病过程[9]。本研究进一步证明，脂多糖诱导了软骨细胞中NLRP3的表达，并促进了Caspase-1的激活。因此，淫羊藿苷可能通过干扰脂多糖介导的NLRP3和Caspase-1信號转导途径来缓解OA。 总之，NLRP3炎性小体在OA的发病中起关键作用。本研究表明，淫羊藿苷通过抑制NLRP3和Caspase-1信号转导来抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤和细胞焦亡，从而减轻大鼠OA。表明淫羊藿苷在OA治疗中具有较好的保护作用，有望成为新的OA治疗药物。
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（2020-07-09收稿 责任编辑：杨觉雄）