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摘要目的:探索沙樱桃黄酮对人肝癌细胞的毒性作用。方法:给予体外培养人肝癌细胞沙樱桃黄酮,用台盼蓝法和流式细胞仪检测其毒性作用。结果:台盼蓝法测定结果显示,给药后培养6小时,沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)组和5-氟尿嘧啶(5-FU)组活细胞数比对照组分别减少了34.3%、43.9%、66.8%和51.2%,到18小时减少了36.4%、52.4%、85.3%和58.2%,差异有显著性(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,细胞周期中G0G1、S期DNA含量明显增加,G2M期显著减少,细胞凋亡率分别为15.4%、23.4%、26.6%。结论:沙樱桃黄酮对人肝癌细胞具有明显的毒性作用,其作用与抑制细胞分裂,促进细胞凋亡有关。
关键词沙樱桃黄酮人肝癌细胞细胞毒性作用
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.11.009
资料与方法
材料:沙樱桃黄酮采用醇提法从民勤沙漠野生沙樱桃果中分离提取制得,实验时,以二甲基亚砜(DMSO)助溶,加RPMI1640培养液配制成所需浓度(二甲基亚砜含量为30μl/L),5-氟尿嘧啶(5-FU),人肝癌细胞(BEL-7402)。
方法:①细胞培养:将复苏的人肝癌细胞置于内含10%的胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的RPMI 1640培养液,5%CO2,37℃,饱和湿度条件中传代培养。②沙樱桃黄酮对人肝癌细胞毒性作用:取培养细胞,调整细胞浓度为1×10.8/L,接种于24孔培养板,每孔1ml,加培养液每孔11ml培养24小时后,给药组分别加入沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)和5-FU(10mg/L),每孔200μl,对照组加等量磷酸盐缓冲液,每组4个重复孔。在5%CO2,37℃,饱和湿度条件中分别培养6、12、18、24、48小时,每孔加0.4%的台盼蓝20μl,用血球计数板在光镜下计活细胞数,取平均值,以培养时间为横坐标,活细胞数为纵坐标作图。③沙樱桃黄酮对人肝癌细胞分裂周期的影响:取20ml培养瓶5个,每瓶加RPMI1640培养液3.5ml,加细胞液(细胞浓度为2×10.9个/L)1ml。沙樱桃黄酮组(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L):每瓶加药500μl;5-FU组:每瓶加5-FU(10mg/L)500μl;对照组加等量的磷酸盐缓冲液。培养48小时后,1000转/分,离心5分钟,弃去上清夜,收集细胞,加75%的冷乙醇2ml固定24小时,离心弃乙醇,加磷酸盐缓冲液洗1次,加入已配好的Rnase(200mg/L)0.5ml,37℃放置4小时以上,离心,弃上清液,磷酸盐缓冲液洗1次,加0.5ml碘化丙啶(PI)20mg/L,4℃,避光染色30分钟后,用流式细胞仪测定凋亡率。
统计学分析:实验数据采用SPSS10.0软件完成统计处理。计量资料差异比较采用DUNNET T单因素方差分析。
结果
沙樱桃黄酮对人肝癌细胞毒性作用:台盼蓝法测定结果显示,分别给予人肝癌细胞沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)和5-FU(10mg/L)培养6、12、18、24、48小时,沙樱桃黄酮组、5-FU组活细胞数随给药浓度的增加和给药后培养时间的延长而减少。其中给药后培养6、18小时,沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)组和5-FU组活细胞数比对照组分别减少了34.3%～36.4%、43.9%～52.4%、66.8%～85.3%和51.2%～58.2%,差异有显著性(P<0.01)。见图1。
图1沙樱桃黄酮对人肝癌细胞毒性作用
沙樱桃黄酮对人肝癌细胞分裂周期的影响:给予人肝癌细胞沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)培养48小时,用流式细胞仪检测显示,细胞周期中G0G1、S期DNA含量明显增加,G2M期显著减少,细胞凋亡率分别为15.4%、23.4%、26.6%;结果见表1。
讨论
沙樱桃果提取物可提高动物小肠蠕动功能,加快营养物质的吸收,促进营养物质的分解利用,提高小鼠游泳耐力、力竭游泳能力、耐缺氧能力,抑制肝组织过氧化脂质的生成,降低肝组织MDA的含量[1]。沙樱桃黄酮对小鼠移植性肿瘤Hep、S180增殖具有明显的抑制作用,能提高小鼠碳粒廓清指数和血清溶血素值,增加免疫器官重量[2],对人肾癌具有明显的抑制作用[3]。本文结果表明,将沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)给予人肝癌细胞体外分别培养6、12、18、24、48小时,活细胞数随给药浓度的增加和给药后培养时间的延长而减少,抑制细胞分裂周期,使分裂期滞于G0G1、S期,进入G2M期显著减少,抑制细胞分裂增殖。
参考文献
1俞发荣,李作平,连秀珍.沙樱桃提取物对运动耐力和抗氧化作用的实验研究.医学综述,2006,12(20):22-24.
2俞发荣,魏克强,连秀珍.沙樱桃黄酮对小鼠Hep、U14抑制作用及其机制探讨.中国药理学通报,2003,19(8):886-888.
3俞发荣,连世军,连秀珍.沙樱桃黄酮对人A-704细胞毒性及增殖的影响.中国药理学通报,2007,23(9):1808-1810.
4俞发荣,冯书涛,连秀珍,等.猫儿眼植物酸对人SGC-7901细胞增殖的影响及其机制探讨.中国药理学通报,2005,21(6):742-745.
关键词沙樱桃黄酮人肝癌细胞细胞毒性作用
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.11.009
资料与方法
材料:沙樱桃黄酮采用醇提法从民勤沙漠野生沙樱桃果中分离提取制得,实验时,以二甲基亚砜(DMSO)助溶,加RPMI1640培养液配制成所需浓度(二甲基亚砜含量为30μl/L),5-氟尿嘧啶(5-FU),人肝癌细胞(BEL-7402)。
方法:①细胞培养:将复苏的人肝癌细胞置于内含10%的胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的RPMI 1640培养液,5%CO2,37℃,饱和湿度条件中传代培养。②沙樱桃黄酮对人肝癌细胞毒性作用:取培养细胞,调整细胞浓度为1×10.8/L,接种于24孔培养板,每孔1ml,加培养液每孔11ml培养24小时后,给药组分别加入沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)和5-FU(10mg/L),每孔200μl,对照组加等量磷酸盐缓冲液,每组4个重复孔。在5%CO2,37℃,饱和湿度条件中分别培养6、12、18、24、48小时,每孔加0.4%的台盼蓝20μl,用血球计数板在光镜下计活细胞数,取平均值,以培养时间为横坐标,活细胞数为纵坐标作图。③沙樱桃黄酮对人肝癌细胞分裂周期的影响:取20ml培养瓶5个,每瓶加RPMI1640培养液3.5ml,加细胞液(细胞浓度为2×10.9个/L)1ml。沙樱桃黄酮组(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L):每瓶加药500μl;5-FU组:每瓶加5-FU(10mg/L)500μl;对照组加等量的磷酸盐缓冲液。培养48小时后,1000转/分,离心5分钟,弃去上清夜,收集细胞,加75%的冷乙醇2ml固定24小时,离心弃乙醇,加磷酸盐缓冲液洗1次,加入已配好的Rnase(200mg/L)0.5ml,37℃放置4小时以上,离心,弃上清液,磷酸盐缓冲液洗1次,加0.5ml碘化丙啶(PI)20mg/L,4℃,避光染色30分钟后,用流式细胞仪测定凋亡率。
统计学分析:实验数据采用SPSS10.0软件完成统计处理。计量资料差异比较采用DUNNET T单因素方差分析。
结果
沙樱桃黄酮对人肝癌细胞毒性作用:台盼蓝法测定结果显示,分别给予人肝癌细胞沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)和5-FU(10mg/L)培养6、12、18、24、48小时,沙樱桃黄酮组、5-FU组活细胞数随给药浓度的增加和给药后培养时间的延长而减少。其中给药后培养6、18小时,沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)组和5-FU组活细胞数比对照组分别减少了34.3%～36.4%、43.9%～52.4%、66.8%～85.3%和51.2%～58.2%,差异有显著性(P<0.01)。见图1。
图1沙樱桃黄酮对人肝癌细胞毒性作用
沙樱桃黄酮对人肝癌细胞分裂周期的影响:给予人肝癌细胞沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)培养48小时,用流式细胞仪检测显示,细胞周期中G0G1、S期DNA含量明显增加,G2M期显著减少,细胞凋亡率分别为15.4%、23.4%、26.6%;结果见表1。
讨论
沙樱桃果提取物可提高动物小肠蠕动功能,加快营养物质的吸收,促进营养物质的分解利用,提高小鼠游泳耐力、力竭游泳能力、耐缺氧能力,抑制肝组织过氧化脂质的生成,降低肝组织MDA的含量[1]。沙樱桃黄酮对小鼠移植性肿瘤Hep、S180增殖具有明显的抑制作用,能提高小鼠碳粒廓清指数和血清溶血素值,增加免疫器官重量[2],对人肾癌具有明显的抑制作用[3]。本文结果表明,将沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)给予人肝癌细胞体外分别培养6、12、18、24、48小时,活细胞数随给药浓度的增加和给药后培养时间的延长而减少,抑制细胞分裂周期,使分裂期滞于G0G1、S期,进入G2M期显著减少,抑制细胞分裂增殖。
参考文献
1俞发荣,李作平,连秀珍.沙樱桃提取物对运动耐力和抗氧化作用的实验研究.医学综述,2006,12(20):22-24.
2俞发荣,魏克强,连秀珍.沙樱桃黄酮对小鼠Hep、U14抑制作用及其机制探讨.中国药理学通报,2003,19(8):886-888.
3俞发荣,连世军,连秀珍.沙樱桃黄酮对人A-704细胞毒性及增殖的影响.中国药理学通报,2007,23(9):1808-1810.
4俞发荣,冯书涛,连秀珍,等.猫儿眼植物酸对人SGC-7901细胞增殖的影响及其机制探讨.中国药理学通报,2005,21(6):742-745.