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摘 要：该文介绍了植物内生真菌分类鉴定的方法，主要包括形态学鉴定和分子生物学鉴定2种方法。
关键词：植物;内生真菌;鉴定
中图分类号 S663.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0036-02
真菌广泛存在于自然界中，且种属繁多，有些菌种形态上并无明显差异，仅靠形态特征或生理、生化指标，很难把握真菌之间的亲缘关系[1]。虽然现代分子生物学技术在真菌分类研究中应用广泛，真菌分类和系统发育研究也取得了很大的进展[2]，但形态学鉴定仍是鉴定真菌的重要参考依据。对真菌进行分类鉴定时，多采用形态学、分子生物学相结合的方法。
1 形态学鉴定
传统的真菌分类主要参照魏景超《真菌鉴定手册》[3]，依据真菌形态、理化特性及超微特征等表型特征，进行初步分类工作。目前形态学的鉴定主要使用光学显微镜和扫描电镜2种技术。
1.1 光学显微镜 根据内生真菌在PDA培养基上的培养特征（生长速度、大小、菌落纹饰、质地、边缘）进行分类及去重复，采用透明胶带法粘贴好菌丝，镜检观察真菌分生孢子梗、分生孢子形态及大小等显微特征，参考文献[4]进行内生真菌的初步分类。
1.2 扫描电镜 近年来，越来越多的学者将扫描电镜技术应用于真菌的形态学鉴定中，传统的光学显微镜虽然也能观察到真菌的基本形态，但真菌的表面超微结构必须使用扫描电镜进行观察，在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌丝、大分生孢子和小分生孢子[5]。采用插片法培养菌株让其菌丝生长与玻璃片表面，取出玻璃片。首先用2.5%戊二醛在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）中固定样品超过4h，然后洗涤3次。在PBS中用1%（W/V）锇酸锇（OsO4）后固定1h，再次洗涤3次。通过一系列乙醇（50，70，80，90，95和100%）将样品在每个步骤脱水约15～20min，转移到乙醇和乙酸异戊酯的混合物（v︰v=1︰1）约30min，然后转移到纯的乙酸异戊酯约1h。最终，在样品表面涂覆上金钯，之后用扫描电子显微镜观察。
2 分子生物学鉴定
目前，在真菌分类方面的较常应用的分子生物学技术主要有核酸序列分析、聚合酶链反应（PCR）、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）、扩增片段长度多态性分析（AFLP）等。
2.1 核酸序列分析 核酸序列分析是目前常用的真菌分类技术之一。真核生物的rDNA单位包含18S、ITS、28S、IGS，其中5.8S两侧有2个内转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）[6]。rDNA基因在真菌中广泛存在，且多拷贝。由于ITS序列不加入成熟核糖体，选择压力比较小，进化速度较快，表现出极为广泛的序列多态性，在进化中形成高度的保守性和一定的变异性，种间差异较为明显[7]。然而，由于特定碱基位点的速率差异或类群之间进化速率的差异等原因造成的基因冲突[8]，目前常用的单基因片段进行的核酸序列分析并不能解决此问题。在此基础上，Tayloretal[9]提出采用多基因片段构建系统发育树从而识别物种的方法（GCPSR），可能会成为真菌鉴定中较常采用的方法。何亚涛[10]等利用ITS和LSU基因构建的系统发育树，证明血红红曲M.sanguineus与紫色红曲M.purpureus为不同种。
2.2 限制性片段长度多态性（RFLP）分析 限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术的原理是不同个体进化过程中，DNA结构存在差异。当DNA序列在限制性内切酶的识别位点发生差异，或当DNA片段的插入、缺失或重排时，限制性内切酶将基因组DNA酶解，产生很多长短不一的片段，这些片段以不同的迁移率经过凝胶电泳，从而被区分出来，就可以获得RFLP图谱进行多态性分析[11-12]。RFLP分析具有数据信息量大、重复性好、结果稳定可靠等优点。但RFLP技术存在对样品纯度要求高，无法检测靶序列中的重复序列之类的缺点[13]。RFLP技术常用于真菌的研究，宋风雅[14]等将PCR-RFLP分析技术应用于橡胶林土壤真菌区系变化的研究，结果显示，随著时间和土壤深度的变化，真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱存在着一定的差异，PCR-RFLP技术能准确反映土壤微生物的动态变化。乔蓬蕾[15]以不同连作茬次黄瓜根际土壤为研究对象，利用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术研究了土壤细菌、真菌菌群结构的动态变化，研究发现黄瓜连作障碍对真菌产生了一定的影响，建立了能解决连作障碍的方法。
2.3 随机扩增多态性DNA（RAPD）分析 RAPD是由Welsh等[15]和Williams等[16]于1990年建立的一种建立在PCR基础上的分子标记手段，RAPD在真菌上主要用于种群变异的研究及种间、种内的区分等，在真菌的系统学研究也有应用。RAPD分析技术所需模板量少，可以适应种及种下各水平的进化分析;因不使用同位素，较为安全;此外还具有速度快、成本低、灵敏度高等特点，但分析结果受很多相关因子的影响[17]，具有一定的使用局限性。龚斌[18]采用RAPD技术对3种红树林植物健康与非健康叶片中真菌进行分类鉴定，对于分离到的157株内生真菌，把它划为19种不同的种，归属2个大的分支。韩利刚[19]选取瓶霉属外瓶霉属8个种的11个菌株，对其进行RAPD扩增，根据分析结果，可将11个菌株划分为8个群，分别代表了8个种，根据最长距离法还可将11个菌株分成两大类，分别代表了瓶霉属和外瓶霉属，这与传统的形态分类法的结果基本一致，证明RAPD技术是研究瓶霉属、外瓶霉属两属间及属内各菌种间的分类和相互关系的有效手段。
2.4 扩增片段长度多态性分析（AFLP） AFLP是基于RFLP与PCR技术的DNA指纹技术，同时具有RAPD技术和RFLP技术优点，灵敏度高，重复性好，结果稳定可靠，适用于各种大小不同的基因组，是一种理想的分子标记[19]。现已广泛用于分类学和系统学等领域，但在真菌上的应用还较少。 但AFLP技术存在扩增时容易出现假阳性、凝胶背景杂乱，难以鉴别等位基因等缺点，导致这项技术具有一定的局限性[20]。张艳菊[21]等利用16对引物对我国8个城市351个供试尖孢镰孢菌进行AFLP分析，结果表明，AFLP标记选择性扩增多态性高，能够揭示大量的多态性位点，可获得亲缘关系很近的菌株间DNA水平上的多态性及亲缘关系，是研究黄瓜枯萎病菌基因组多态性的一种较为高效的分子标记技术。卓英[22]采用AFLP技术分析了收集到的31个主要香菇栽培菌株的DNA多态性。采用6对引物共扩增得到了443条DNA带，其中共有条带为189条，多态性比率为57.34%，可为香菇的栽培菌株质量监测和菌种鉴定提供快速有效的技术手段。
3 结语
随着现代生物技术的高速发展，出现了许多更为快速有效的鉴定方法，为真菌分类提供了更多的有效帮助。在进行真菌分类时，可以根据需要选择较为符合实际情况的方法。
参考文献
[1]杨祝良.基因组学时代的真菌分类学：机遇与挑战[J].菌物学报，2013，32（6）：931-946.
[2]Yang Z L .Molecular techniques revolutionize knowledge of basidiomycete evolution[J].Fungal Diversity，2011，50（1）：47-58.
[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
[4]徐佳，陈彬，雷晓凌，等.丛生盔形珊瑚共附生可培养真菌多样性分析[J].微生物学通报，2011，38（8）：1193-1198.
[5]唐芳，欧阳毅，祁智慧.基于扫描电镜观察研究真菌孢子检测对稻谷霉变判定[J].中国粮油学报，2018，33（4）： 122-126.
[6]余知和，曾昭清.DNA分子标记技术在真菌系统学研究中的应用及影响[J].菌物学报，2013，32（1）.
[7]李倩，闫淑珍，陈双林.基于rDNA ITS序列对绒泡菌目黏菌系统发育的探讨[J].菌物学报，2015，34（3）.
[8]邹新慧，葛颂.基因树冲突与系统发育基因组学研究[J].植物分类学报，2008，46（6）：795-807.
[9]Taylor J W，Jacobson D J，Kroken S，et al.Phylogenetic Species Recognition and Species Concepts in Fungi[J].Fungal Genetics & Biology，2000，31（1）：0-32.
[10]何亚涛，冉琴琴，柳玉瑛，等.基于多基因分析对我国红曲霉属Monascus真菌的系统发育研究[J].菌物学报，2018，37（09）：48-63.
[11]方炳良.限制性片段长度多态性分析[J].基础医学与临床，1991（6）：376-380.
[12]刘宁，金保伟，胡景辉，等.真菌分类中分子生物学方法的原理及其应用[J].华北农学报，2017.
[13]余知和，曾昭清.DNA分子标记技术在真菌系统学研究中的应用及影响[J].菌物学报，2013，32（1）.
[14]徐传林，李会军，李萍，等.川贝母药材分子鉴定方法研究[J].中国药科大学学报，2010（3）：226-230.
[15]Welsh J，Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（24）：7213-7218.
[16]Williams J G K，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.
[17]龔斌，方怀义，刘小雪，等.三种红树林植物健康与非健康叶片中真菌的比较[J].广西植物，2017（3）.
[18]李敏慧，向梅梅.RAPD在真菌分类鉴定上的应用[J].仲恺农业工程学院学报，2003，16（1）：61-67.
[19]裴德翠.AFLP：DNA指纹分析的有力手段[J].微生物学免疫学进展，2002，30（3）：66-70.
[20]张传博，苏晓庆.几种基于基因组DNA的真菌分类技术研究进展[J].贵州师范大学学报（自然科学版），2006，24（1）.
[21]张艳菊，陈霞，刘东，等.黄瓜枯萎病菌遗传多样性的AFLP分析[J].植物病理学报，2011，41（3）：301-304.
[22]卓英，谭琦，陈明杰，等.香菇主要栽培菌株遗传多样性的AFLP分析[J].菌物学报，2006，25（2）.
（责编：张宏民）
关键词：植物;内生真菌;鉴定
中图分类号 S663.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）10-0036-02
真菌广泛存在于自然界中，且种属繁多，有些菌种形态上并无明显差异，仅靠形态特征或生理、生化指标，很难把握真菌之间的亲缘关系[1]。虽然现代分子生物学技术在真菌分类研究中应用广泛，真菌分类和系统发育研究也取得了很大的进展[2]，但形态学鉴定仍是鉴定真菌的重要参考依据。对真菌进行分类鉴定时，多采用形态学、分子生物学相结合的方法。
1 形态学鉴定
传统的真菌分类主要参照魏景超《真菌鉴定手册》[3]，依据真菌形态、理化特性及超微特征等表型特征，进行初步分类工作。目前形态学的鉴定主要使用光学显微镜和扫描电镜2种技术。
1.1 光学显微镜 根据内生真菌在PDA培养基上的培养特征（生长速度、大小、菌落纹饰、质地、边缘）进行分类及去重复，采用透明胶带法粘贴好菌丝，镜检观察真菌分生孢子梗、分生孢子形态及大小等显微特征，参考文献[4]进行内生真菌的初步分类。
1.2 扫描电镜 近年来，越来越多的学者将扫描电镜技术应用于真菌的形态学鉴定中，传统的光学显微镜虽然也能观察到真菌的基本形态，但真菌的表面超微结构必须使用扫描电镜进行观察，在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌丝、大分生孢子和小分生孢子[5]。采用插片法培养菌株让其菌丝生长与玻璃片表面，取出玻璃片。首先用2.5%戊二醛在磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）中固定样品超过4h，然后洗涤3次。在PBS中用1%（W/V）锇酸锇（OsO4）后固定1h，再次洗涤3次。通过一系列乙醇（50，70，80，90，95和100%）将样品在每个步骤脱水约15～20min，转移到乙醇和乙酸异戊酯的混合物（v︰v=1︰1）约30min，然后转移到纯的乙酸异戊酯约1h。最终，在样品表面涂覆上金钯，之后用扫描电子显微镜观察。
2 分子生物学鉴定
目前，在真菌分类方面的较常应用的分子生物学技术主要有核酸序列分析、聚合酶链反应（PCR）、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）、扩增片段长度多态性分析（AFLP）等。
2.1 核酸序列分析 核酸序列分析是目前常用的真菌分类技术之一。真核生物的rDNA单位包含18S、ITS、28S、IGS，其中5.8S两侧有2个内转录间隔区ITS（internal transcribed spacer）[6]。rDNA基因在真菌中广泛存在，且多拷贝。由于ITS序列不加入成熟核糖体，选择压力比较小，进化速度较快，表现出极为广泛的序列多态性，在进化中形成高度的保守性和一定的变异性，种间差异较为明显[7]。然而，由于特定碱基位点的速率差异或类群之间进化速率的差异等原因造成的基因冲突[8]，目前常用的单基因片段进行的核酸序列分析并不能解决此问题。在此基础上，Tayloretal[9]提出采用多基因片段构建系统发育树从而识别物种的方法（GCPSR），可能会成为真菌鉴定中较常采用的方法。何亚涛[10]等利用ITS和LSU基因构建的系统发育树，证明血红红曲M.sanguineus与紫色红曲M.purpureus为不同种。
2.2 限制性片段长度多态性（RFLP）分析 限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术的原理是不同个体进化过程中，DNA结构存在差异。当DNA序列在限制性内切酶的识别位点发生差异，或当DNA片段的插入、缺失或重排时，限制性内切酶将基因组DNA酶解，产生很多长短不一的片段，这些片段以不同的迁移率经过凝胶电泳，从而被区分出来，就可以获得RFLP图谱进行多态性分析[11-12]。RFLP分析具有数据信息量大、重复性好、结果稳定可靠等优点。但RFLP技术存在对样品纯度要求高，无法检测靶序列中的重复序列之类的缺点[13]。RFLP技术常用于真菌的研究，宋风雅[14]等将PCR-RFLP分析技术应用于橡胶林土壤真菌区系变化的研究，结果显示，随著时间和土壤深度的变化，真菌18SrDNA的PCR-RFLP图谱存在着一定的差异，PCR-RFLP技术能准确反映土壤微生物的动态变化。乔蓬蕾[15]以不同连作茬次黄瓜根际土壤为研究对象，利用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术研究了土壤细菌、真菌菌群结构的动态变化，研究发现黄瓜连作障碍对真菌产生了一定的影响，建立了能解决连作障碍的方法。
2.3 随机扩增多态性DNA（RAPD）分析 RAPD是由Welsh等[15]和Williams等[16]于1990年建立的一种建立在PCR基础上的分子标记手段，RAPD在真菌上主要用于种群变异的研究及种间、种内的区分等，在真菌的系统学研究也有应用。RAPD分析技术所需模板量少，可以适应种及种下各水平的进化分析;因不使用同位素，较为安全;此外还具有速度快、成本低、灵敏度高等特点，但分析结果受很多相关因子的影响[17]，具有一定的使用局限性。龚斌[18]采用RAPD技术对3种红树林植物健康与非健康叶片中真菌进行分类鉴定，对于分离到的157株内生真菌，把它划为19种不同的种，归属2个大的分支。韩利刚[19]选取瓶霉属外瓶霉属8个种的11个菌株，对其进行RAPD扩增，根据分析结果，可将11个菌株划分为8个群，分别代表了8个种，根据最长距离法还可将11个菌株分成两大类，分别代表了瓶霉属和外瓶霉属，这与传统的形态分类法的结果基本一致，证明RAPD技术是研究瓶霉属、外瓶霉属两属间及属内各菌种间的分类和相互关系的有效手段。
2.4 扩增片段长度多态性分析（AFLP） AFLP是基于RFLP与PCR技术的DNA指纹技术，同时具有RAPD技术和RFLP技术优点，灵敏度高，重复性好，结果稳定可靠，适用于各种大小不同的基因组，是一种理想的分子标记[19]。现已广泛用于分类学和系统学等领域，但在真菌上的应用还较少。 但AFLP技术存在扩增时容易出现假阳性、凝胶背景杂乱，难以鉴别等位基因等缺点，导致这项技术具有一定的局限性[20]。张艳菊[21]等利用16对引物对我国8个城市351个供试尖孢镰孢菌进行AFLP分析，结果表明，AFLP标记选择性扩增多态性高，能够揭示大量的多态性位点，可获得亲缘关系很近的菌株间DNA水平上的多态性及亲缘关系，是研究黄瓜枯萎病菌基因组多态性的一种较为高效的分子标记技术。卓英[22]采用AFLP技术分析了收集到的31个主要香菇栽培菌株的DNA多态性。采用6对引物共扩增得到了443条DNA带，其中共有条带为189条，多态性比率为57.34%，可为香菇的栽培菌株质量监测和菌种鉴定提供快速有效的技术手段。
3 结语
随着现代生物技术的高速发展，出现了许多更为快速有效的鉴定方法，为真菌分类提供了更多的有效帮助。在进行真菌分类时，可以根据需要选择较为符合实际情况的方法。
参考文献
[1]杨祝良.基因组学时代的真菌分类学：机遇与挑战[J].菌物学报，2013，32（6）：931-946.
[2]Yang Z L .Molecular techniques revolutionize knowledge of basidiomycete evolution[J].Fungal Diversity，2011，50（1）：47-58.
[3]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.
[4]徐佳，陈彬，雷晓凌，等.丛生盔形珊瑚共附生可培养真菌多样性分析[J].微生物学通报，2011，38（8）：1193-1198.
[5]唐芳，欧阳毅，祁智慧.基于扫描电镜观察研究真菌孢子检测对稻谷霉变判定[J].中国粮油学报，2018，33（4）： 122-126.
[6]余知和，曾昭清.DNA分子标记技术在真菌系统学研究中的应用及影响[J].菌物学报，2013，32（1）.
[7]李倩，闫淑珍，陈双林.基于rDNA ITS序列对绒泡菌目黏菌系统发育的探讨[J].菌物学报，2015，34（3）.
[8]邹新慧，葛颂.基因树冲突与系统发育基因组学研究[J].植物分类学报，2008，46（6）：795-807.
[9]Taylor J W，Jacobson D J，Kroken S，et al.Phylogenetic Species Recognition and Species Concepts in Fungi[J].Fungal Genetics & Biology，2000，31（1）：0-32.
[10]何亚涛，冉琴琴，柳玉瑛，等.基于多基因分析对我国红曲霉属Monascus真菌的系统发育研究[J].菌物学报，2018，37（09）：48-63.
[11]方炳良.限制性片段长度多态性分析[J].基础医学与临床，1991（6）：376-380.
[12]刘宁，金保伟，胡景辉，等.真菌分类中分子生物学方法的原理及其应用[J].华北农学报，2017.
[13]余知和，曾昭清.DNA分子标记技术在真菌系统学研究中的应用及影响[J].菌物学报，2013，32（1）.
[14]徐传林，李会军，李萍，等.川贝母药材分子鉴定方法研究[J].中国药科大学学报，2010（3）：226-230.
[15]Welsh J，Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（24）：7213-7218.
[16]Williams J G K，Kubelik A R，Livak K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucleic Acids Research，1990，18（22）：6531-6535.
[17]龔斌，方怀义，刘小雪，等.三种红树林植物健康与非健康叶片中真菌的比较[J].广西植物，2017（3）.
[18]李敏慧，向梅梅.RAPD在真菌分类鉴定上的应用[J].仲恺农业工程学院学报，2003，16（1）：61-67.
[19]裴德翠.AFLP：DNA指纹分析的有力手段[J].微生物学免疫学进展，2002，30（3）：66-70.
[20]张传博，苏晓庆.几种基于基因组DNA的真菌分类技术研究进展[J].贵州师范大学学报（自然科学版），2006，24（1）.
[21]张艳菊，陈霞，刘东，等.黄瓜枯萎病菌遗传多样性的AFLP分析[J].植物病理学报，2011，41（3）：301-304.
[22]卓英，谭琦，陈明杰，等.香菇主要栽培菌株遗传多样性的AFLP分析[J].菌物学报，2006，25（2）.
（责编：张宏民）