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【中图分类号】R681.8 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）05-0003-01
由于创伤、酗酒和滥用激素等原因，骨科疑难病症--股骨头坏死的发病率明显增加。各种原因造成的股骨头内血液循环障碍是股骨头坏死的关键病机；力学强度下降导致股骨头塌陷是该病发展的重要转折。如果能在围塌陷期采取有效措施，改善血供和重建股骨头的力学强度，可防止塌陷和促进骨修复，保存髋关节功能。骨科界对此做了很多研究，但目前还难以同时解决好这两个问题。木豆叶水提物有活血化瘀，补肾健骨作用，是治疗股骨头坏死的有效藥物。我们拟在前期研究的基础上，将它与高强度、可控制、完全降解性复合材料（CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺）制成一种缓释系统，随着复合材料逐步降解，药物持续释放，达到早期重建力学强度，全程改善血供、促进修复和保留自身股骨头的目的。
1 材料与方法
1.1 CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺树脂复合材料的制备 采用溶胶-凝胶技术制备纳米 HA 微粒，并用不饱和聚酯酰胺树脂或聚乳酸包覆处理。利用原位聚合技术，将不饱和聚酯酰胺树脂液态低聚物溶解在丙酮中，再慢慢把适量的n-HA 倒入混合液中强磁力搅拌，同时超声波处理直到n-HA 完全分散在聚酯酰胺树脂液态低聚物丙酮溶液中，后慢慢升高体系温度直到丙酮完全蒸发，将分散体系加入到含引发剂过氧化苯甲酰的交联剂（乙烯基砒咯烷酮或乙酸乙烯酯）溶液中混合均匀，再用滴管滴入适量的促进剂。以上述含n-HA 和交联剂及引发-促进剂为基体，CPPF为增强体，利用手铺成型法制备CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺树脂复合材料，并在室温下预交联成型，然后加一定热压以提高其密实度，最后在适当的温度下热处理深度交联以提高复合材料力学性能，制备出高强度、高模量生物活性可控降解吸收速率的复合材料，并将其由特制车床制成呈中空圆柱状，近端钝圆，外径6mm，长20mm，壁厚1.5mm，四周围有散在的小孔，直径1mm。
1.2 木豆叶水提物/CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺复合材料的制备 取一定量的木豆叶，加10倍量的水煎煮3 次，每次1.5h，合并煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10（60℃），喷雾干燥即得。按照CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺的制备方法，在加入n-HA 的同时加入适量的木豆叶水提物，最后获得木豆叶水提物/CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺复合物，并制成前述的多孔棒状。
1.3 建立股骨头坏死模型 36 只兔随机分为4 组：A、B、C、D 组（分别为空白对照组、自体松质骨组、CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺组和木豆叶水提物/ CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物组）在3%戊巴比妥静脉麻醉下，取双髋关节前外侧切口，显露并脱位股骨头。用橡皮管包绕股骨头，周围软组织保护，液氮持续灌注3 min，造成股骨头坏死模型。
1.4 分组处理 造模后A 组不作处理；B 组进行髓芯减压，在髂骨处取自体松质骨通过减压孔填充；C 组进行髓芯减压，通过减压孔填充多孔棒状CPPF/n-HA不饱和聚酯酰胺复合物；D 组进行髓芯减压，通过减压孔填充多孔棒状木豆叶水提物/ CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物。手术 6，12，24 周后，分别处死各组3 只兔，取下股骨头。将股骨头沿中央冠状锯开，进行石蜡切片苏木精-伊红染色和血管内皮细胞生长因子（VEGF）免疫组化染色，光镜下观察髓芯减压区骨缺损修复情况及新骨形成情况；记录单位面积内空骨陷窝率、VEGF 阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率。
1.5 统计学分析 单位面积内空骨陷窝率、VEGF阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率等数据用SPSS分析软件进行分析，多组间资料采用F检查和t检查。
2 结果
2.1 苏木精-伊红染色 造模术后第6周时，A组病理切片，股骨头内出现骨坏死，单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多。12周时单位面积骨细胞稀少，空骨陷窝多。坏死区与正常骨组织之间出现硬化带。24周时硬化带两侧有肉芽生长，关节软骨退变，软骨细胞减少，排列紊乱。
B组病理切片，6周时，股骨头坏死区域内单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多，植骨区域有可见空骨陷窝少，成骨细胞数目增多，并有散在的破骨细胞。12周时植骨区与坏死区交界处有肉芽生长，可见成骨细胞和破骨细胞。24周时有新生血管由植骨区向坏死区长入，有新生骨小梁形成，关节软骨退变，外表欠平整，软骨细胞排列紊乱。
C组病理切片，6周时，股骨头坏死区域内单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多，复合材料植入区域可见边缘变模糊。12周时材料植入区与坏死区交界处有少量肉芽生长，可见少量成骨细胞和破骨细胞。24周时有新生血管由植骨区向坏死区长入，有新生骨小梁形成，关节软骨退变不明显，软骨细胞排列呈柱状。
D组病理切片，6周时，股骨头坏死区域内单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多，复合材料植入区域可见边缘变模糊，有肉芽组织和新生血管长入。12周时肉芽组织出现钙化，可见较多成骨细胞和破骨细胞。24周时有新生血管由植骨区向坏死区长入，有新生骨小梁形成，关节软骨退变不明显，软骨细胞排列呈柱状。
各组空骨陷窝率的比较数据参见表1，D组和B组的空骨陷窝率明显低于A组和C组，有显著性差异（P<0.05）。
2.2 免疫组化染色
对免疫复合物沉积部位和免疫反应强度的观察，以在细胞膜、细胞质和基质中出现黄棕色反应产物为阳性。D组VEGF免疫阳性反应明显强于其他3组。各组的VEGF阳性血管率见表2，其中D组VEGF阳性血管率较其他3组明显增多（P<0.05）。各组的VEGF阳性成骨细胞率见表3，其中D组VEGF阳性成骨细胞率较其他3组明显增多（P<0.05）。
3 讨论
聚乳酸（PLA）是种具有良好生物相容性的可完全降解吸收的材料，在体内降解成乳酸，进入三羧酸循环，最终产物为CO2和H2O，对人体无毒害，因此在医用领域中广泛应用为药物缓释材料、体内植入材料、手术缝合线、骨科内固定材料以及组织工程材料等[1]虽然聚乳酸具有良好的生物相容性和可降解吸收性，但也存在以下一些问题：（1）亲水性不够，对细胞黏附性弱；（2）降解产物偏酸性，不利于细胞生长；（3）作为骨组织支架材料，其机械强度和强度保持时间不稳定。因此，单一的聚乳酸材料应用受到限制，而聚乳酸类复合材料的研究越来越多。目前，与聚乳酸复合的材料有多种，如含无机钙质成分的聚乳酸类复合材料：羟基磷灰石（HA）/PLA、磷酸三钙（TCP）/PLA；含有机成分的聚乳酸类复合材料：甲壳素（CHI）/PLA、明胶/PLA。
CPP纤维是一种生物相容性好、高强度、可生物降解吸收的无机纤维，最近也被应用于与聚乳酸复合制备CPP纤维/PLA复合材料。石宗利[2]等用CPP纤维为增强材料，PLLA为基体材料，制备出高强度、高模量完全降解吸收性CPP/PLLA连续纤维及短纤维复合材料，并对该复合材料的力学性能及其降解性能进行了系列的研究，结果表明：CPP/PLLA复合材料的力学性能和降解性能满足松质骨或部分皮质骨的骨内固定材料的性能要求。
我们根据股骨头内坏死这一特定疾病的特殊性，认为其修复既要考虑成骨修复、血运供应修复，又要考虑较长时间内要保持一定的力学性能，在前人和自已前期研究的的基础上，设计制备木豆叶水提物/CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物，并加工成多孔棒状，用于对兔股骨头坏死病灶进行填充、支撑和修复。实验显示C组和D组的股骨头外形、关节软骨优于A、B两组； D组血管的生长和修复优于其他3组，表明CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物能够起到力学支撑作用，加入木豆叶后，更能促进血管的生长和修复，加速缺血区的再血管化。并且随着时间的推移，复合物也开始降解，实验期内股骨头未出现塌陷情况，关节软骨退变的程度也较轻。因此，这可能是治疗股骨头坏死的一种新的方法，当然，本研究存在时间短，实验动物例数偏少，有待今后进一步扩大和深入研究。
参考文献：
[1] Kxicheldoxf H R. Syntheses and application of Polylactics. Chemophexe， 2001，43：49-54.
[2] 石宗利，张媛，强小虎等.CPP/PLLA单向纤维骨内固定复合材料制备和性能.机械工程学报，2004，40 （11）：53-57.
本论文受江西省科技厅支撑项目资助，课题编号：20111BBG70004-3
由于创伤、酗酒和滥用激素等原因，骨科疑难病症--股骨头坏死的发病率明显增加。各种原因造成的股骨头内血液循环障碍是股骨头坏死的关键病机；力学强度下降导致股骨头塌陷是该病发展的重要转折。如果能在围塌陷期采取有效措施，改善血供和重建股骨头的力学强度，可防止塌陷和促进骨修复，保存髋关节功能。骨科界对此做了很多研究，但目前还难以同时解决好这两个问题。木豆叶水提物有活血化瘀，补肾健骨作用，是治疗股骨头坏死的有效藥物。我们拟在前期研究的基础上，将它与高强度、可控制、完全降解性复合材料（CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺）制成一种缓释系统，随着复合材料逐步降解，药物持续释放，达到早期重建力学强度，全程改善血供、促进修复和保留自身股骨头的目的。
1 材料与方法
1.1 CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺树脂复合材料的制备 采用溶胶-凝胶技术制备纳米 HA 微粒，并用不饱和聚酯酰胺树脂或聚乳酸包覆处理。利用原位聚合技术，将不饱和聚酯酰胺树脂液态低聚物溶解在丙酮中，再慢慢把适量的n-HA 倒入混合液中强磁力搅拌，同时超声波处理直到n-HA 完全分散在聚酯酰胺树脂液态低聚物丙酮溶液中，后慢慢升高体系温度直到丙酮完全蒸发，将分散体系加入到含引发剂过氧化苯甲酰的交联剂（乙烯基砒咯烷酮或乙酸乙烯酯）溶液中混合均匀，再用滴管滴入适量的促进剂。以上述含n-HA 和交联剂及引发-促进剂为基体，CPPF为增强体，利用手铺成型法制备CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺树脂复合材料，并在室温下预交联成型，然后加一定热压以提高其密实度，最后在适当的温度下热处理深度交联以提高复合材料力学性能，制备出高强度、高模量生物活性可控降解吸收速率的复合材料，并将其由特制车床制成呈中空圆柱状，近端钝圆，外径6mm，长20mm，壁厚1.5mm，四周围有散在的小孔，直径1mm。
1.2 木豆叶水提物/CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺复合材料的制备 取一定量的木豆叶，加10倍量的水煎煮3 次，每次1.5h，合并煎液，过滤，滤液浓缩至相对密度为1.05～1.10（60℃），喷雾干燥即得。按照CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺的制备方法，在加入n-HA 的同时加入适量的木豆叶水提物，最后获得木豆叶水提物/CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺复合物，并制成前述的多孔棒状。
1.3 建立股骨头坏死模型 36 只兔随机分为4 组：A、B、C、D 组（分别为空白对照组、自体松质骨组、CPPF/n-HA/不饱和聚酯酰胺组和木豆叶水提物/ CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物组）在3%戊巴比妥静脉麻醉下，取双髋关节前外侧切口，显露并脱位股骨头。用橡皮管包绕股骨头，周围软组织保护，液氮持续灌注3 min，造成股骨头坏死模型。
1.4 分组处理 造模后A 组不作处理；B 组进行髓芯减压，在髂骨处取自体松质骨通过减压孔填充；C 组进行髓芯减压，通过减压孔填充多孔棒状CPPF/n-HA不饱和聚酯酰胺复合物；D 组进行髓芯减压，通过减压孔填充多孔棒状木豆叶水提物/ CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物。手术 6，12，24 周后，分别处死各组3 只兔，取下股骨头。将股骨头沿中央冠状锯开，进行石蜡切片苏木精-伊红染色和血管内皮细胞生长因子（VEGF）免疫组化染色，光镜下观察髓芯减压区骨缺损修复情况及新骨形成情况；记录单位面积内空骨陷窝率、VEGF 阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率。
1.5 统计学分析 单位面积内空骨陷窝率、VEGF阳性血管率、VEGF阳性成骨细胞率等数据用SPSS分析软件进行分析，多组间资料采用F检查和t检查。
2 结果
2.1 苏木精-伊红染色 造模术后第6周时，A组病理切片，股骨头内出现骨坏死，单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多。12周时单位面积骨细胞稀少，空骨陷窝多。坏死区与正常骨组织之间出现硬化带。24周时硬化带两侧有肉芽生长，关节软骨退变，软骨细胞减少，排列紊乱。
B组病理切片，6周时，股骨头坏死区域内单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多，植骨区域有可见空骨陷窝少，成骨细胞数目增多，并有散在的破骨细胞。12周时植骨区与坏死区交界处有肉芽生长，可见成骨细胞和破骨细胞。24周时有新生血管由植骨区向坏死区长入，有新生骨小梁形成，关节软骨退变，外表欠平整，软骨细胞排列紊乱。
C组病理切片，6周时，股骨头坏死区域内单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多，复合材料植入区域可见边缘变模糊。12周时材料植入区与坏死区交界处有少量肉芽生长，可见少量成骨细胞和破骨细胞。24周时有新生血管由植骨区向坏死区长入，有新生骨小梁形成，关节软骨退变不明显，软骨细胞排列呈柱状。
D组病理切片，6周时，股骨头坏死区域内单位面积骨细胞减少，空骨陷窝增多，复合材料植入区域可见边缘变模糊，有肉芽组织和新生血管长入。12周时肉芽组织出现钙化，可见较多成骨细胞和破骨细胞。24周时有新生血管由植骨区向坏死区长入，有新生骨小梁形成，关节软骨退变不明显，软骨细胞排列呈柱状。
各组空骨陷窝率的比较数据参见表1，D组和B组的空骨陷窝率明显低于A组和C组，有显著性差异（P<0.05）。
2.2 免疫组化染色
对免疫复合物沉积部位和免疫反应强度的观察，以在细胞膜、细胞质和基质中出现黄棕色反应产物为阳性。D组VEGF免疫阳性反应明显强于其他3组。各组的VEGF阳性血管率见表2，其中D组VEGF阳性血管率较其他3组明显增多（P<0.05）。各组的VEGF阳性成骨细胞率见表3，其中D组VEGF阳性成骨细胞率较其他3组明显增多（P<0.05）。
3 讨论
聚乳酸（PLA）是种具有良好生物相容性的可完全降解吸收的材料，在体内降解成乳酸，进入三羧酸循环，最终产物为CO2和H2O，对人体无毒害，因此在医用领域中广泛应用为药物缓释材料、体内植入材料、手术缝合线、骨科内固定材料以及组织工程材料等[1]虽然聚乳酸具有良好的生物相容性和可降解吸收性，但也存在以下一些问题：（1）亲水性不够，对细胞黏附性弱；（2）降解产物偏酸性，不利于细胞生长；（3）作为骨组织支架材料，其机械强度和强度保持时间不稳定。因此，单一的聚乳酸材料应用受到限制，而聚乳酸类复合材料的研究越来越多。目前，与聚乳酸复合的材料有多种，如含无机钙质成分的聚乳酸类复合材料：羟基磷灰石（HA）/PLA、磷酸三钙（TCP）/PLA；含有机成分的聚乳酸类复合材料：甲壳素（CHI）/PLA、明胶/PLA。
CPP纤维是一种生物相容性好、高强度、可生物降解吸收的无机纤维，最近也被应用于与聚乳酸复合制备CPP纤维/PLA复合材料。石宗利[2]等用CPP纤维为增强材料，PLLA为基体材料，制备出高强度、高模量完全降解吸收性CPP/PLLA连续纤维及短纤维复合材料，并对该复合材料的力学性能及其降解性能进行了系列的研究，结果表明：CPP/PLLA复合材料的力学性能和降解性能满足松质骨或部分皮质骨的骨内固定材料的性能要求。
我们根据股骨头内坏死这一特定疾病的特殊性，认为其修复既要考虑成骨修复、血运供应修复，又要考虑较长时间内要保持一定的力学性能，在前人和自已前期研究的的基础上，设计制备木豆叶水提物/CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物，并加工成多孔棒状，用于对兔股骨头坏死病灶进行填充、支撑和修复。实验显示C组和D组的股骨头外形、关节软骨优于A、B两组； D组血管的生长和修复优于其他3组，表明CPPF/n-HA /不饱和聚酯酰胺复合物能够起到力学支撑作用，加入木豆叶后，更能促进血管的生长和修复，加速缺血区的再血管化。并且随着时间的推移，复合物也开始降解，实验期内股骨头未出现塌陷情况，关节软骨退变的程度也较轻。因此，这可能是治疗股骨头坏死的一种新的方法，当然，本研究存在时间短，实验动物例数偏少，有待今后进一步扩大和深入研究。
参考文献：
[1] Kxicheldoxf H R. Syntheses and application of Polylactics. Chemophexe， 2001，43：49-54.
[2] 石宗利，张媛，强小虎等.CPP/PLLA单向纤维骨内固定复合材料制备和性能.机械工程学报，2004，40 （11）：53-57.
本论文受江西省科技厅支撑项目资助，课题编号：20111BBG70004-3