探讨氟砷联合暴露对大鼠成骨细胞(OB)增殖、分化及β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响。
方法取12只出生1~3 d sprague dawley(SD)大鼠乳鼠颅盖骨,采用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离OB后进行传代培养。取第三代OB,采用析因实验设计(2因素3水平)方法分成9组[F0.0As0.0(对照组)、F0.5As0.0、F4.0As0.0、F0.0As0.1、F0.0As10.0、F0.5As0.1、F0.5As10.0、F4.0As0.1、F4.0As10.0],其中氟化钠(F-)分别为0.0、0.5、4.0 mmol/L,F0.0、F0.5、F4.0,亚砷酸钠(As3+)分别为0.0、0.1、10.0 μmol/L,As0.0、As0.1、As10.0,染毒干预72 h。染毒结束后采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应(MTT)比色法检测各染毒组OB增殖率;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养液中碱性磷酸酶(ALP)活性,用以分析对OB分化的影响;采用SYBR Green荧光定量PCR法检测细胞中β-catenin mRNA表达;采用免疫蛋白印迹(Western blot)法检测β-catenin蛋白表达。
结果①大鼠OB在处理72 h后,OB增殖率[吸光度(A)]、ALP活性(U/L)组间差异有统计学意义(F= 14.022、14.425,P均< 0.05),与对照组比较,F0.5As0.0组表现为促进OB增殖,提高ALP活性(0.313 ±0.023 vs 0.455 ±0.152,4.46 ± 0.72 vs 6.09 ± 0.68,P均< 0.05),而F4.0As0.0组为抑制OB增殖(0.029 ± 0.014,P < 0.05);与对照组比较,F0.0As0.1组表现为促进OB增殖、降低ALP活性(0.370 ± 0.029,3.68 ± 0.45,P均< 0.05),而F0.0As10.0组表现为抑制OB增殖、提高ALP活性(0.156 ± 0.010,6.29 ± 0.67,P均< 0.05)。②As0.0时,各染氟组β-catenin mRNA表达及其蛋白表达比较差异有统计学意义(F= 7.782、559.455,P均< 0.05),与对照组比较,F0.5As0.0组β-catenin mRNA及蛋白的表达显著升高(1.00 ± 0.32 vs 1.99 ± 0.14,3.56 ± 0.15 vs 5.11 ± 0.26,P均< 0.05),而F4.0As0.0组β-catenin蛋白降低明显(1.10 ± 0.02,P < 0.05);F0.0时,各染砷组β-catenin蛋白表达比较差异有统计学意义(F= 154.736,P < 0.05)。③氟、砷对OB的增殖率、β-catenin mRNA及其蛋白表达均有主效应(F= 82.081、11.991、514.741;19.302、8.753、523.698,P均< 0.05),砷对ALP活性影响也表现为主效应(F= 17.444,P < 0.05);氟砷联合对OB增殖、分化、β-catenin mRNA及其蛋白均具有交互作用(F= 13.085、18.157、4.936、426.036,P均< 0.05)。
结论氟、砷均可以通过影响大鼠OB增殖、分化及β-catenin mRNA及蛋白表达,影响骨的重建过程。