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【摘要】 目的 研究血管老化相关内皮细胞衰老的机制。方法 选择12h新生儿脐带，采用胶原酶、DMEM培养基等试剂对血管内皮细胞进行培养，然后采用显微镜和超薄切片机、流式细胞仪、显微镜等仪器进行鉴定分析。结果 在实验中加入TNF-α刺激的内皮细胞细胞衰老加快，刺激因子的细胞与正常细胞相比较，增值指数明显降低，差异有统计学意义。结论 TNF-α可以加速细胞衰老。
【关键词】 血管老化内皮细胞衰老TNF-α
【中图分类号】R339.3+8 ; R329.2+8【文献标识码】A【文章编号】1671-5160(2014)02-0015-01 衰老是指随着年龄的增长，人的机体发生组织功能的退化过程。衰老的一个重要表现就是血管老化，血管衰老是一个错综缝扎的过程，包括组织、细胞、分子水平等复杂的变化过程。影响血管衰老的因素也是多种多样的，如生存环境、生活习惯，遗传因素等等。目前人类对于血管衰老的认识水平还处于低级阶段，因此相关方面的研究具有深远意义。
1资料与方法
1.1 材料和仪器
材料：12 h内新生儿脐带；DMEM培养基；胎牛血清；EDTA；DMSO；总一氧化氮检测试剂盒；细胞周期流式细胞分析试剂盒；细胞衰老特异性P -半乳糖苷酶检测试剂盒；端粒酶活性检测试剂盒；Wester Blot配胶试剂盒；脱脂奶粉；Pierce BCA Protein Assay Kit；根过氧化物酶标记(HRP)的山羊抗兔IgG；兔抗人Caveolin-1及eNOS单克隆抗体；蛋白质 Marker；兔抗人P -actin单克隆抗体；PVDF 膜；ECL发光液；富士医疗用X胶片胶片；PBS缓冲液；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2x,液体)；RIPA裂解液(液体)；Protease inhibitor cocktail tablets；细胞培养瓶；培养板[1]。
仪器：FEI Tecnai G212 型透射电子显微镜；倒置显微镜 ；流式细胞仪；离心机；Leica UCT 超薄切片机 ；恒温水浴箱；超净工作台；培养箱；恒温箱。
1.2操作方法
1.2.1人脐静脉内皮细胞的提取与培养
取15cm左右的新鲜脐带，用PBS冲洗干净。注入10 ml左右的0.25%胰蛋白酶。当细胞间出现明显间隙时加入含10%新生牛血清培养液终止消化。PBS冲2次后，注入离心管中。常温离心5 min。加入新鲜培养液，37℃条件下培养。2d换液，轻柔吹打，重悬传代。
1.2.2脐静脉内皮细胞的鉴定
选取第二代细胞进行细胞鉴定。投入冷丙酮中孵化7 min，进行免疫组化染色。加入VWF单克隆抗体放入湿盒内培养8-10h，然后加入辣根过氧化酶标记的二抗25μl，在37℃条件下孵育2h，PBS冲洗5次，每次1 min。用DAB显色试剂盒显色。最后观察鉴定。
1.2.3NO含量测定
使用的总一氧化氮检测试剂盒通过经典的Griess reagent检测测出硝酸盐及亚硝酸盐量，从而推算出NO的总量。取上清液100ml放入试管中，沸腾5min，离心5min。用无血清的DMEM将lOmmol/L KNO2稀释，并设置空白对照。每孔加入30Ul酶混合液，混匀后540nm测定吸光度，从而推算NO浓度。
1.2.4电子显微镜观察细胞传代过程中细胞超微结构的改变
电子显微镜观察鉴定2~7代细胞。PBS冲洗，离心10min，注入0.25%胰酶终止消化，将细胞团放入试管中。用2.5%戊二醛缓冲固定液固定，用乙醇丙酮脱水，1：1丙酮环氧树脂混合物和纯环氧树脂包埋剂各浸泡2 h，包埋、聚合、修块后用德国超薄切片机切片，最后透射电镜观察鉴定。
1.3数据处理和统计分析
每组实验重复3次（n=3）。 采用SPSS11.5软件对两组患者进行统计分析，计量资料用（ ±s）表示，采用t 检验。计数资料用百分率表示，采用x2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1电镜下观察内皮细胞传代过程中形态学变化
在实验中，透射电镜下观察正常脐静脉内皮细胞，细胞呈圆形，胞核呈圆形或卵圆形，轮廓清晰，表面有细绒毛。线粒体数量多而密集，部分线粒体处于内质网的环绕之中。内质网发达多呈密集平行排列的扁束池状，染色质核内分布均匀。相比之下，传代过程中的衰老细胞，其外形千奇百怪，轮廓不清晰，伪足众多。线粒体和内质网数量明显减少，胞核不规则，核仁消失，有的出现曲核、核裂。核染色质结块或浓集，其他部位的染色质基本消失。相当数量的内质网和线粒体出现肿胀和变形，有的细胞浆中还存在空泡[2]。
2.2不同代次内皮细胞的周期分析
S期的细胞增殖较快，G1~S 期比例不断下降，G2~M期的比例呈上升趋势。在传代末期，细胞生长逐渐停滞，六代和八代细胞与二代和第四代细胞的统计数据比较，P<0.01，差异具有统计学意义。加入TNF-α之后，内皮细胞细胞增值指数明显降低，增值指数有较大差异，差异有统计学意义。
注：P <0.01，差异具有统计学意义。
3讨论
生命是一个过程，其中衰老是不可避免的，随着年龄的增长，机体的各项功能便会逐渐下降。细胞是人体的最基本的构成要素，因此，机体的衰老是从细胞的衰老开始的，同时也与细胞衰老有着密切的关系。血管内皮系统处于血液与血管之间，是人体的重要的组成部分。它的衰老不可避免地会引起各种疾病，例如心脑血管疾病。
从实验中我们可以看出，脐静脉内皮细胞在传代过程中，不同阶段的细胞的形态和特征各不相同，在细胞早期电镜观察可见人脐静脉内皮细胞最开始是球形，伸展较少，2~3d是生长高峰期，变成梭形。可以清晰观察细胞核，但细胞轮廓尚不清晰。7~10 d细胞变为多角形，嵌合在一起。传代后期，内皮细胞生长逐渐缓慢，细胞逐渐衰老，体积增大，轮廓变清晰，胞浆变混浊，随着传代次数的增加，贴壁能力减低，贴壁细胞活力也相应降低，最终自然脱壁死亡。另外在实验中我们发现，随着时间的推移衰老细胞内质网、线粒体等明显退化，能量产生严重降低、分泌功能也发展为分泌障碍，这种现象表明细胞功能减退，细胞衰老。本试验证明TNF-α能够引起血管内皮细胞生长形态的明显变化，加速细胞的衰老过程。另外，细胞传代过程中，染色质形态也会发生变化。
4结论
TNF-α刺激的内皮细胞与正常细胞相比较，增值指数明显降低，细胞衰老加快，导致细胞脱落死亡。从而导致血管内膜逐渐变得粗糙，单核细胞浸润和纤维蛋白原、血小板附着增加容易导致各种疾病，因此必须加以控制。
参考文献
[1]邹美圣.灵芝多糖对血管紧张素II诱导的人脐静脉内皮细胞衰老的影响及机制研究[D].广州中医大学，2012:5-10.
[2]姜平,黎健.血管衰老及其机制[J].生物化学与生物物理进展,2014, 41(3): 295~304.
作者简介：李萍，性别：女，籍贯：湖南长沙，出生年月：1978年5月，学位：本科， 工作单位：湖南省脑科医院神经内科
【关键词】 血管老化内皮细胞衰老TNF-α
【中图分类号】R339.3+8 ; R329.2+8【文献标识码】A【文章编号】1671-5160(2014)02-0015-01 衰老是指随着年龄的增长，人的机体发生组织功能的退化过程。衰老的一个重要表现就是血管老化，血管衰老是一个错综缝扎的过程，包括组织、细胞、分子水平等复杂的变化过程。影响血管衰老的因素也是多种多样的，如生存环境、生活习惯，遗传因素等等。目前人类对于血管衰老的认识水平还处于低级阶段，因此相关方面的研究具有深远意义。
1资料与方法
1.1 材料和仪器
材料：12 h内新生儿脐带；DMEM培养基；胎牛血清；EDTA；DMSO；总一氧化氮检测试剂盒；细胞周期流式细胞分析试剂盒；细胞衰老特异性P -半乳糖苷酶检测试剂盒；端粒酶活性检测试剂盒；Wester Blot配胶试剂盒；脱脂奶粉；Pierce BCA Protein Assay Kit；根过氧化物酶标记(HRP)的山羊抗兔IgG；兔抗人Caveolin-1及eNOS单克隆抗体；蛋白质 Marker；兔抗人P -actin单克隆抗体；PVDF 膜；ECL发光液；富士医疗用X胶片胶片；PBS缓冲液；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2x,液体)；RIPA裂解液(液体)；Protease inhibitor cocktail tablets；细胞培养瓶；培养板[1]。
仪器：FEI Tecnai G212 型透射电子显微镜；倒置显微镜 ；流式细胞仪；离心机；Leica UCT 超薄切片机 ；恒温水浴箱；超净工作台；培养箱；恒温箱。
1.2操作方法
1.2.1人脐静脉内皮细胞的提取与培养
取15cm左右的新鲜脐带，用PBS冲洗干净。注入10 ml左右的0.25%胰蛋白酶。当细胞间出现明显间隙时加入含10%新生牛血清培养液终止消化。PBS冲2次后，注入离心管中。常温离心5 min。加入新鲜培养液，37℃条件下培养。2d换液，轻柔吹打，重悬传代。
1.2.2脐静脉内皮细胞的鉴定
选取第二代细胞进行细胞鉴定。投入冷丙酮中孵化7 min，进行免疫组化染色。加入VWF单克隆抗体放入湿盒内培养8-10h，然后加入辣根过氧化酶标记的二抗25μl，在37℃条件下孵育2h，PBS冲洗5次，每次1 min。用DAB显色试剂盒显色。最后观察鉴定。
1.2.3NO含量测定
使用的总一氧化氮检测试剂盒通过经典的Griess reagent检测测出硝酸盐及亚硝酸盐量，从而推算出NO的总量。取上清液100ml放入试管中，沸腾5min，离心5min。用无血清的DMEM将lOmmol/L KNO2稀释，并设置空白对照。每孔加入30Ul酶混合液，混匀后540nm测定吸光度，从而推算NO浓度。
1.2.4电子显微镜观察细胞传代过程中细胞超微结构的改变
电子显微镜观察鉴定2~7代细胞。PBS冲洗，离心10min，注入0.25%胰酶终止消化，将细胞团放入试管中。用2.5%戊二醛缓冲固定液固定，用乙醇丙酮脱水，1：1丙酮环氧树脂混合物和纯环氧树脂包埋剂各浸泡2 h，包埋、聚合、修块后用德国超薄切片机切片，最后透射电镜观察鉴定。
1.3数据处理和统计分析
每组实验重复3次（n=3）。 采用SPSS11.5软件对两组患者进行统计分析，计量资料用（ ±s）表示，采用t 检验。计数资料用百分率表示，采用x2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1电镜下观察内皮细胞传代过程中形态学变化
在实验中，透射电镜下观察正常脐静脉内皮细胞，细胞呈圆形，胞核呈圆形或卵圆形，轮廓清晰，表面有细绒毛。线粒体数量多而密集，部分线粒体处于内质网的环绕之中。内质网发达多呈密集平行排列的扁束池状，染色质核内分布均匀。相比之下，传代过程中的衰老细胞，其外形千奇百怪，轮廓不清晰，伪足众多。线粒体和内质网数量明显减少，胞核不规则，核仁消失，有的出现曲核、核裂。核染色质结块或浓集，其他部位的染色质基本消失。相当数量的内质网和线粒体出现肿胀和变形，有的细胞浆中还存在空泡[2]。
2.2不同代次内皮细胞的周期分析
S期的细胞增殖较快，G1~S 期比例不断下降，G2~M期的比例呈上升趋势。在传代末期，细胞生长逐渐停滞，六代和八代细胞与二代和第四代细胞的统计数据比较，P<0.01，差异具有统计学意义。加入TNF-α之后，内皮细胞细胞增值指数明显降低，增值指数有较大差异，差异有统计学意义。
注：P <0.01，差异具有统计学意义。
3讨论
生命是一个过程，其中衰老是不可避免的，随着年龄的增长，机体的各项功能便会逐渐下降。细胞是人体的最基本的构成要素，因此，机体的衰老是从细胞的衰老开始的，同时也与细胞衰老有着密切的关系。血管内皮系统处于血液与血管之间，是人体的重要的组成部分。它的衰老不可避免地会引起各种疾病，例如心脑血管疾病。
从实验中我们可以看出，脐静脉内皮细胞在传代过程中，不同阶段的细胞的形态和特征各不相同，在细胞早期电镜观察可见人脐静脉内皮细胞最开始是球形，伸展较少，2~3d是生长高峰期，变成梭形。可以清晰观察细胞核，但细胞轮廓尚不清晰。7~10 d细胞变为多角形，嵌合在一起。传代后期，内皮细胞生长逐渐缓慢，细胞逐渐衰老，体积增大，轮廓变清晰，胞浆变混浊，随着传代次数的增加，贴壁能力减低，贴壁细胞活力也相应降低，最终自然脱壁死亡。另外在实验中我们发现，随着时间的推移衰老细胞内质网、线粒体等明显退化，能量产生严重降低、分泌功能也发展为分泌障碍，这种现象表明细胞功能减退，细胞衰老。本试验证明TNF-α能够引起血管内皮细胞生长形态的明显变化，加速细胞的衰老过程。另外，细胞传代过程中，染色质形态也会发生变化。
4结论
TNF-α刺激的内皮细胞与正常细胞相比较，增值指数明显降低，细胞衰老加快，导致细胞脱落死亡。从而导致血管内膜逐渐变得粗糙，单核细胞浸润和纤维蛋白原、血小板附着增加容易导致各种疾病，因此必须加以控制。
参考文献
[1]邹美圣.灵芝多糖对血管紧张素II诱导的人脐静脉内皮细胞衰老的影响及机制研究[D].广州中医大学，2012:5-10.
[2]姜平,黎健.血管衰老及其机制[J].生物化学与生物物理进展,2014, 41(3): 295~304.
作者简介：李萍，性别：女，籍贯：湖南长沙，出生年月：1978年5月，学位：本科， 工作单位：湖南省脑科医院神经内科