论文部分内容阅读
摘要：采用常规皮内变态反应（TST方法）对唐山、秦皇岛、沧州和石家庄四个市共计2204头奶牛进行牛结核病检测，采用IFN-γ试验方法对PPD检测结果为阳性、可疑的牛以及部分阴性牛进行复检。将IFN-γ试验与TST检测结果相比较，其敏感性为78.26%，特异性为89.09%，符合率为84.33%。研究表明单独使用PPD皮内变态反应方法在牛结核病的诊断方面存在特异性差的缺点，用IFN-γ试验对TST试验阳性和可疑牛进行复检可以提高特异性，避免造成假阳性牛的误杀；该方法在临床上适合推广应用。
关键词：奶牛结核病；皮内变态反应；IFN-γ试验
牛结核病（Bovine Tuherculosis）是由分支杆菌属牛分枝杆菌所引起的一种慢性消耗性传染病，由于该病也感染人，所以是人畜共患病。该病虽然能够感染猪、鹿、猴等动物，但牛最易感；而在牛中，黄牛和牦牛感染级别较大，水牛易感性较高，但奶牛最易感染。我国将该病列为二类动物疫病，而OIE将其列为需通报的B类动物疫病。当前，人民对牛奶和牛肉的需求量较大，我国奶牛业发展较快，但通过对人结核病患者病原统计分析，有10%结核病病原为牛分枝杆菌，故该病控制的好坏，直接关系到奶牛养殖业的发展和居民的身体健康，因此及时检测、淘汰结核感染的奶牛具有重要的现实意义。
牛全血干扰素试验方法（牛IFN-γ试验方法）是牛结核诊断的一种新型的牛结核诊断方法，由Wood等首先将该方法用于牛结核病的检测，而澳大利亚利采用该方法作为牛结核病根除计划的首选试验方法运用于临床，效果显著，并于1997年底宣布消灭了牛结核病。当前，该方法在欧盟和美国等发达国家也得到了承认，成为继TET方法之外的唯一的法定活畜牛结核病诊断试验。当前我国主要采用颈部皮试变态反应（TST法）来进行牛结核病的检疫，对阳性牛进行扑杀，对可疑牛隔离后再次进行检疫，而国外采用的用于牛结核病检疫的牛IFN-γ试验方法目前在我国尚未正式推荐使用。由于TST法存在非特异性强、假阳性率高的特点，加之我国对扑杀奶牛经济补偿价偏低，这给基层动物疫控系统严格执行牛结核病的检疫、扑杀政策带来了了巨大的阻力。即要做到不提高检测成本，又要做到降低其检测结果的非特异性，是当前在牛结核的检疫中亟需解决的问题。本研究引入IFN-γ试验法，并同TST法的试验结果进行比较分析，来探讨分析其在实际工作中的应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验动物
奶牛来自唐山市、秦皇岛市、沧州市和石家庄市的奶牛场，总共2204头（四个市分别为937头、356头、398头和513头）。
1.2 主要试剂
BOVIGAM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒，购自Prionics AG公司（批号：6339900101）；牛型PPD（牛型提纯结核菌素），购自哈药集团生物疫苗有限公司（批号：201304）。
1.3 方法
1.3.1 TST试验和IFN-γ试验按照说明书规定的方法进行。
1.3.2 2种方法的符合率、敏感性和特异性比较按照如下公式计算：
符合率=（真阳性数+真阴性数）/被检总数、敏感性=真阳性数/（真阳性数+假阴性数）、特异性=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）。
2 结果
2.1 TST试验
2.2 IFN-γ试验
2.3 符合率、敏感性和特异性比较
3 分析与讨论
本研究中对TST试验方法检出的60头结核病阳性牛进行IFN-γ试验方法检测，检出牛型结核36头、禽型结核牛6头；对TST试验方法检出的121头可疑牛进行IFN-γ试验方法检测，检出牛型结核10头、禽型结核牛13头。从检测数据可以看出，部分皮内变态反应阳性牛呈现出假阳性结果，若单独用该方法检出的PPD阳性牛实行扑杀策略，势必误杀部分假阳性牛。而对于皮内变态反应可疑的牛，需要在60d后进行复检，仍为可疑的，需要再过60 d再次进行复检，这无疑造成了病原的扩散和疫情处置的延误。我们对TST发检m的36头阴性牛进行lFN-γ检测，结果全部阴性；而徐贤坤（2010）等对PPD检m的25头阴性牛进行IFN-γ检测，结果检出了5头假阴性牛，与我们的结果不相符，这可能与检测的数量多少和选择针对性样品不同有关。
对217份奶牛样本进行牛结核病IFN-γ试验和TST试验比较，结果其敏感性、特异性和符合率分别为78.26%、89.09%和84.33%，而徐贤坤（2010）等检测的结果分别为53.33%、70.49%和67.11%；朱冬冬（2010）等检测结果分别为30.30%、82.05%和39.56%，我们的结果均比他们的高。
资料显示，对TST试验后2-28d内的奶牛采样进行IFN-γ试验检测，其敏感性和特异性不受影响。但我们对牛群进行TST检测后40d、28d、14d和3d的样品进行IFN-γ试验结果表明，两种方法检测间隔越短，其阳性符合率越高，出现的假阳性或假阴性越少。虽然在牛结核检疫中可以不进行TST试验方法检测，直接进行IFN-γ试验检测，但其高昂的价格（160元/份）和繁琐的试验过程，不适合在我国基层进行大面积推广。我们认为，在对奶牛进行TST试验后3-5d，对检测出的阳性及可疑牛采样进行lFN-γ试验检测是比较理想的。这样不仅降低检疫成本，还可以避免误杀部分假阳性牛。
由于存在迟发型变态反应现象，试验TST检测中，对72h呈现可疑的奶牛一定要观察到96h或120h，否则会出现阳性牛漏检现象。我们在对沧州市的奶牛进行TST检测时，有一头奶牛在72 h时皮厚差为1.18mm，到96h时皮厚差为2.56mm。对该奶牛采样进行IFN-γ试验检测，结果牛结核阳性。
国内部分学者对牛结核的其他检测方法也进行比较分析。张喜悦（2010）等认为γ-干扰素试验和国外比较变态反应之间具有较好的阳性符合率，国内牛PPD与国外牛PPD试验结果相似，但国内常规皮试的特异性很低，而将国内皮试改进为国内比较皮试，则与国外常规的比较皮试具有较好的阳性符合率；金璐娟（2004）等采用变态反应与ELISA同时对奶牛结核病进行检测.并以剖检进行验证，结果表明变态反应阳性并不能全包括ELISA阳性。变态反应与剖检的符合率为3.14%；而ELISA与剖检的符合率为75%，ELISA检测具有较好的特异性。谢志勤（2010）等应用牛结核菌素对广西奶水牛进行牛结核病皮内变态反应的检测，然后对皮内变态反应阳性牛采样进行分离培养、γ-干扰素ELISA和PCR方法检测，比较这四种检测方法的符合率，结果表明γ-干扰素ELISA和PCR方法检测具有较好的特异性，可以作为变态反应检测的补充。有关该方面的比较分析，有待于我们今后进一步研究。
总之，将PPD的TST试验方法同IFN-γ检测方法联合用于牛结核病的检疫，将有效提高检测方法的特异性和准确度，适合在我国推广应用。
关键词：奶牛结核病；皮内变态反应；IFN-γ试验
牛结核病（Bovine Tuherculosis）是由分支杆菌属牛分枝杆菌所引起的一种慢性消耗性传染病，由于该病也感染人，所以是人畜共患病。该病虽然能够感染猪、鹿、猴等动物，但牛最易感；而在牛中，黄牛和牦牛感染级别较大，水牛易感性较高，但奶牛最易感染。我国将该病列为二类动物疫病，而OIE将其列为需通报的B类动物疫病。当前，人民对牛奶和牛肉的需求量较大，我国奶牛业发展较快，但通过对人结核病患者病原统计分析，有10%结核病病原为牛分枝杆菌，故该病控制的好坏，直接关系到奶牛养殖业的发展和居民的身体健康，因此及时检测、淘汰结核感染的奶牛具有重要的现实意义。
牛全血干扰素试验方法（牛IFN-γ试验方法）是牛结核诊断的一种新型的牛结核诊断方法，由Wood等首先将该方法用于牛结核病的检测，而澳大利亚利采用该方法作为牛结核病根除计划的首选试验方法运用于临床，效果显著，并于1997年底宣布消灭了牛结核病。当前，该方法在欧盟和美国等发达国家也得到了承认，成为继TET方法之外的唯一的法定活畜牛结核病诊断试验。当前我国主要采用颈部皮试变态反应（TST法）来进行牛结核病的检疫，对阳性牛进行扑杀，对可疑牛隔离后再次进行检疫，而国外采用的用于牛结核病检疫的牛IFN-γ试验方法目前在我国尚未正式推荐使用。由于TST法存在非特异性强、假阳性率高的特点，加之我国对扑杀奶牛经济补偿价偏低，这给基层动物疫控系统严格执行牛结核病的检疫、扑杀政策带来了了巨大的阻力。即要做到不提高检测成本，又要做到降低其检测结果的非特异性，是当前在牛结核的检疫中亟需解决的问题。本研究引入IFN-γ试验法，并同TST法的试验结果进行比较分析，来探讨分析其在实际工作中的应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验动物
奶牛来自唐山市、秦皇岛市、沧州市和石家庄市的奶牛场，总共2204头（四个市分别为937头、356头、398头和513头）。
1.2 主要试剂
BOVIGAM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒，购自Prionics AG公司（批号：6339900101）；牛型PPD（牛型提纯结核菌素），购自哈药集团生物疫苗有限公司（批号：201304）。
1.3 方法
1.3.1 TST试验和IFN-γ试验按照说明书规定的方法进行。
1.3.2 2种方法的符合率、敏感性和特异性比较按照如下公式计算：
符合率=（真阳性数+真阴性数）/被检总数、敏感性=真阳性数/（真阳性数+假阴性数）、特异性=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）。
2 结果
2.1 TST试验
2.2 IFN-γ试验
2.3 符合率、敏感性和特异性比较
3 分析与讨论
本研究中对TST试验方法检出的60头结核病阳性牛进行IFN-γ试验方法检测，检出牛型结核36头、禽型结核牛6头；对TST试验方法检出的121头可疑牛进行IFN-γ试验方法检测，检出牛型结核10头、禽型结核牛13头。从检测数据可以看出，部分皮内变态反应阳性牛呈现出假阳性结果，若单独用该方法检出的PPD阳性牛实行扑杀策略，势必误杀部分假阳性牛。而对于皮内变态反应可疑的牛，需要在60d后进行复检，仍为可疑的，需要再过60 d再次进行复检，这无疑造成了病原的扩散和疫情处置的延误。我们对TST发检m的36头阴性牛进行lFN-γ检测，结果全部阴性；而徐贤坤（2010）等对PPD检m的25头阴性牛进行IFN-γ检测，结果检出了5头假阴性牛，与我们的结果不相符，这可能与检测的数量多少和选择针对性样品不同有关。
对217份奶牛样本进行牛结核病IFN-γ试验和TST试验比较，结果其敏感性、特异性和符合率分别为78.26%、89.09%和84.33%，而徐贤坤（2010）等检测的结果分别为53.33%、70.49%和67.11%；朱冬冬（2010）等检测结果分别为30.30%、82.05%和39.56%，我们的结果均比他们的高。
资料显示，对TST试验后2-28d内的奶牛采样进行IFN-γ试验检测，其敏感性和特异性不受影响。但我们对牛群进行TST检测后40d、28d、14d和3d的样品进行IFN-γ试验结果表明，两种方法检测间隔越短，其阳性符合率越高，出现的假阳性或假阴性越少。虽然在牛结核检疫中可以不进行TST试验方法检测，直接进行IFN-γ试验检测，但其高昂的价格（160元/份）和繁琐的试验过程，不适合在我国基层进行大面积推广。我们认为，在对奶牛进行TST试验后3-5d，对检测出的阳性及可疑牛采样进行lFN-γ试验检测是比较理想的。这样不仅降低检疫成本，还可以避免误杀部分假阳性牛。
由于存在迟发型变态反应现象，试验TST检测中，对72h呈现可疑的奶牛一定要观察到96h或120h，否则会出现阳性牛漏检现象。我们在对沧州市的奶牛进行TST检测时，有一头奶牛在72 h时皮厚差为1.18mm，到96h时皮厚差为2.56mm。对该奶牛采样进行IFN-γ试验检测，结果牛结核阳性。
国内部分学者对牛结核的其他检测方法也进行比较分析。张喜悦（2010）等认为γ-干扰素试验和国外比较变态反应之间具有较好的阳性符合率，国内牛PPD与国外牛PPD试验结果相似，但国内常规皮试的特异性很低，而将国内皮试改进为国内比较皮试，则与国外常规的比较皮试具有较好的阳性符合率；金璐娟（2004）等采用变态反应与ELISA同时对奶牛结核病进行检测.并以剖检进行验证，结果表明变态反应阳性并不能全包括ELISA阳性。变态反应与剖检的符合率为3.14%；而ELISA与剖检的符合率为75%，ELISA检测具有较好的特异性。谢志勤（2010）等应用牛结核菌素对广西奶水牛进行牛结核病皮内变态反应的检测，然后对皮内变态反应阳性牛采样进行分离培养、γ-干扰素ELISA和PCR方法检测，比较这四种检测方法的符合率，结果表明γ-干扰素ELISA和PCR方法检测具有较好的特异性，可以作为变态反应检测的补充。有关该方面的比较分析，有待于我们今后进一步研究。
总之，将PPD的TST试验方法同IFN-γ检测方法联合用于牛结核病的检疫，将有效提高检测方法的特异性和准确度，适合在我国推广应用。