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摘 要 采用5种前处理方法分别对5个样品进行处理，并对HPLC测定咖啡因含量的前处理方法进行优化和改进，建立了3种准确、快速、安全的适宜不同样品的咖啡因提取测定方法，其中三氯甲烷超声萃取法效果最佳。该方法测定FAPAS对照样品的咖啡因，其含量为395.47 mg/kg，相对误差为0.9%，回收率达100.97%。该方法操作简单、耗时少、精密度及准确度高、测定适用范围广。
关键词 咖啡及其制品；前处理；咖啡因
中图分类号 S571.2 文献标识码 A
Pretreatment Methods for Determination of Caffeine
in Coffee and Its Products by HPLC
ZOU Dongmei，YUAN Hongqiu， WU Qiong，
TANG Yongjiao， PANG Yongbo， XU Zhi
Analysis and Testing Centre， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract Five pretreatment methods were used for five samples of coffee and its products respectively. The methods for extracting caffeine and HPLC determination of caffeine content of the samples were optimized and improved， and three new methods for caffeine determination were established. And they are accurate， rapid， safe and suitable for extracting caffeine from different samples. The results showed that the method of chloroform together with ultrasonic extraction was the best， and using this method to determine the caffeine content of FAPAS control sample showed that its caffeine content was 395.47 mg/kg， the relative error was 0.9% and the recovery rate was 100.97%. Meanwhile， the method had advantages of simple operation， less time consuming， high precision and accuracy， and it had features of wide application.
Key words Coffee and its products；Pretreatment determination methods；Caffeine content
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.031
咖啡因（caffeine）又名咖啡碱，化学名称为1，3，7，-三甲基黄嘌呤，属生物碱类化合物。它具有等刺激中枢神经作用，对神经系统、心脑血管系统、消化系统、肿瘤化疗的生化调节、神经官能症和偏头痛等均有一些积极作用[1-2]，但易上瘾。目前，测定咖啡因的方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、碘量法、重量法和分子印迹毛细管整体柱液相色谱法等，常用的方法为高效液相色谱法（HPLC）[3-7]。传统的HPLC测定前处理方法操作繁琐，且咖啡因提取率不高，导致重复性差、准确度低。为建立准确、快速、操作简便的咖啡因HPLC测定的前处理方法，本研究在现有相关标准基础上对提取测定方法进行研究和优化，比较不同前处理方法咖啡因测定结果的差异性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 待测材料 样品材料5个（表1），样品经粉碎并过25目筛后待测。
1.1.2 主要试剂和仪器 咖啡因标准品（纯度大于99.9%）购自国药集团上海化学试剂公司；Waters 高效液相色谱仪（Waters e2695，配有2489紫外检测器）。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理 样品前处理方法共5种，其中处理3～5为本研究建立的新方法，分别如下：
处理1：按照GB/T 19182-2003/ISO 10095：1992试样处理方法[3]。
处理2：按照GB/T 5009.139-2003第二法高效液相色谱法[4]。
处理3：称取样品0.5～1.0 g（精确至0.000 1 g）于150 mL的锥形瓶中，先加2～3 mL超纯水，再加50 mL三氯甲烷，加盖摇匀，在超声处理机上萃取5 min，静置30 min，分层。将萃取液移入另一250 mL的锥形瓶中，在试样中再加40 mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并2次萃取液，加入5 mL饱和氯化钠和少量无水硫酸钠（至液面无水花），过滤100 mL容量瓶中（用三氯甲烷洗锥形瓶和滤纸2次），用三氯甲烷定容至100 mL。吸取10.00 mL滤液到50 mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10 mL容量瓶中定容。吸取1～2 mL用0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶待测（弃去前3滴）。 处理4：分别称取样品1.0 g（精确至0.000 1 g）于150 mL 的锥形瓶中，加入4.0 g氧化镁，再加入100 mL 蒸馏水，在恒温振荡水浴锅中90 ℃水浴中浸提30 min，将溶液静置，冷却至室温后过滤，滤液移入100 mL的容量瓶中，并用蒸馏水定容，稀释10倍后，取1～2 mL过0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶待测（弃去前3滴）。
处理5：分别称取样品1.0 g（精确至0.000 1 g）于150 mL的锥形瓶中， 加入80 mL沸水， 加盖摇匀，在恒温振荡水浴锅中90 ℃水浴中浸提30 min，将溶液静置， 冷却至室温，然后将浸出液全部移入100 mL容量瓶中， 加入2 mL醋酸锌溶液（200 g/L）， 加入2 mL亚铁氰化钾溶液100 g/L， 摇匀， 用超纯水定容100 mL， 摇匀， 静置沉淀，过滤。准确吸取10 mL滤液至250 mL分液漏斗中，然后加入5 mL高锰酸钾溶液（15 g/L）， 摇匀， 静置5 min， 加入10 mL的亚硫酸钠（100 g/L）和硫氰酸钾（100 g/L）混合溶液（V ∶ V=1 ∶ 1），摇匀后，加入50 mL三氯甲烷。振摇100次（或2 min），静止分层并收集三氯甲烷。在水层中再加入40 mL三氯甲烷，振摇100次（或2 min），静置分层。合并2次三氯甲烷萃取液，并用三氯甲烷定容至100 mL，摇匀。吸10 mL滤液到25 mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入100 mL容量瓶中定容。取1 ～2 mL过0.22 μm微孔滤膜过滤至上机瓶待测（弃去最初3滴）。
1.2.2 准确度测定 参考物质测试：以表1中的样品1（参考物质）为试样，样品前处理分别按1.2.1所述5种处理方法提取咖啡因并测定其含量。每种处理方法6个重复，比较测定值的平均值与样品1（参考物质）参考值，以测定5处理种方法的准确度。
加标回收率测试：以样品1（参考物质）为试样，按1.2.1所述5处理种方法进行加标回收率试验，每种方法3个水平的加标回收，即在称取的样品中分别添加200、300、400 μg的咖啡因。依据加标量及测定值计算每种处理方法各个水平的加标回收率，以比较5种处理方法的准确度。
1.2.3 精密度及测定适用范围测定 按1.2.1所述5种前处理方法分别对4个不同咖啡因含量的样品（编号分别为2、3、4、5）进行前处理并测定咖啡因含量。每种处理方法重复做6个平行，依据测定值计算其相对标准偏差（RSD范围值≤2%），以比较5种处理方法的精密度及测定适用范围。
1.2.4 标准溶液的配制 用万分之一的电子分析天平称取咖啡因标准品40.0 mg，将其移入50 mL的容量瓶中，并用超纯水定容，即配得咖啡因标准品母液（500 μg/mL）。再用移液管精确移取0.5、1、1.5、2、3 mL 的母液，分别移入 50 mL的容量瓶中，并用超纯水定容，即得到浓度为5、10、15、20、30 μg /mL的标准品溶液。
1.2.5 色谱条件 色谱柱：Sun Fire C18 柱（4.6 mm×150 mm； 5μm）； 流动相： 甲醇 ∶ 水（V ∶ V=30 ∶ 70）； 流速： 1 mL/min；检测波长：272 nm；柱温为 35 ℃。
1.2.6 色谱测定 分别对5个样品的待测溶液进行测定，每个样品重复6次，待测样品进样6次，记录色谱图，采用外标法计算其含量。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
通过Waters 高效液相色谱仪分析建立标准样品的咖啡因色谱图（图1），咖啡因的保留时间约为4.4 min。以峰面积分值Y（μV·s）为纵坐标，标准溶液浓度X（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线（图2），计算回归方程，咖啡因标准曲线方程为：Y=2.626 78 X+1.233 13；相关系数R2=0.999 9。
2.2 5种处理方法的准确度比较
2.2.1 5种不同前处理方法的测定值与参考物质的比较 由表2可知，处理1和处理2所测定的咖啡因含量分别为132.68、216.16 mg/kg，低于对照样品，相对误差分别为45.8%、66.7%；处理3～5所测定的咖啡因含量分别为395.47、367.36、376.99 mg/kg，与对照样品相比，相对误差分别为0.9%、7.9%和5.5%，其中处理3的准确度最高。除处理1测定的咖啡因含量的RSD值<2%外，处理2～5的咖啡因含量的RSD值均小于2，说明这4种处理方法的测定精密度较高。
2.2.2 加标回收率结果 由表3可知，5种处理方法的回收率分别为39.13%、69.27%、100.97%、96.68%和94.12%，RSD值分别为1.84%、1.94%、0.60%、1.55%和1.71%，其中处理3的回收率（正常范围为80%～120%）最高，准确度也最高。
2.3 3种新前处理方法的精密度与重复性比较
分别采用处理3、4、5对样品2、3、4、5进行前处理测定咖啡因含量，精密度试验结果如表4，重复性试验结果如表5。3种处理方法的RSD值均小于2%，说明3种处理方法的精密度高。在重复性试验中，每个样品重复6次，每次重复进样6次，计算6组的咖啡因含量平均值，RSD值也均小于2，说明3种处理方法的重复性好。因此，3种前处理方法适用于不同样品的咖啡因含量测定。
2.4 5种前处理方法的综合比较
由表6可知，处理3最准确、简单、快速、安全，峰型好、杂质峰少（图3），适用于精密测定咖啡及其制品中的咖啡因的含量，处理4和5准确度较好，处理4适用大批量样品的快速测定，处理5没有杂质峰，可用于科研分析或提取纯化咖啡因。
3 讨论与结论
本研究建立了3种准确、简单、快速、安全的适合不同样品的咖啡因前处理定方法，即处理3、处理4、处理5。其测定结果明显优于目前的国家标准（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003），即处理1和处理2。主要存在以下改进： 处理3（三氯甲烷超声萃取法）在处理2的基础上进行了改进，测定方法准确、精密。该方法的超声萃取时间由处理2的1 min变为5 min，色谱条件采用GB/T 19182-2003。2013年8月，笔者参加FAPAS的能力验证（全球共73家单位参加），采用处理3提取样品2和样品3（考核样）并测定咖啡因含量，标准分数（z-score）值分别是-0.1和0.2。标准分数的绝对值小于或等于2，则通过能力验证，说明处理3测定结果的准确度高并获得国际认可。
处理4（90 ℃水浴浸提取法）在处理1的基础上进行了改进，测定方法安全、简便、高效。该方法在水浴浸提时间和纯化等方面进行改进，由处理1和国际标准（ISO 20481-2008）在恒温振荡水浴锅中90 ℃水浴中浸提20 min变为30 min，同时省去了提取液质量称重、溶液的提纯、咖啡因的吸收、脱除不需要的化合物、咖啡因的洗提等5个步骤，溶液冷却过滤后直接上机测样。但是该前处理提取的咖啡因含杂质较多，影响准确度和色谱柱的使用寿命。
处理5（90 ℃水浴中浸提，三氯甲烷萃取法）的色谱峰较纯净且准确，该方法综合了处理1和处理2，即90 ℃水浴中浸提30 min后采用GB/T 5009.139-2003中紫外分光光谱法的试样处理，但操作较繁琐。
我国农业标准一般每3～5年修订1次，但现行有效的国家标准（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003）标龄已有10 a，它不但操作繁琐，而且在溶液提纯过程中既难操作又不经济，准确度和重复性也较差，建议有关部门尽快修订该标准。本研究中，处理1和4以90 ℃水浴浸提取，没有使用有害的有机溶剂，相对于其它3种方法的安全性更高；其余3种提取方法使用三氯甲烷（低毒，对环境有危害，对水有污染）作为提取剂，如果操作人员经过专门培训，严格遵守操作规程（密闭操作，局部排风），对人和环境不会造成明显的安全问题。三氯甲烷超声萃取法作为测定咖啡及其制品中咖啡因含量的前处理方法，其效果最佳，该方法具有操作简单、耗时少、精密度和重现性好、回收率高、测定适用范围广等特点，将为今后咖啡及其制品中咖啡因含量的测定提供技术参考。
参考文献
[1] 赵灵芝， 苏兴文， 银 巍，等. 咖啡因对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用及机制[J]. 中国药理学通报， 2004， 20（12）： 1 370-1 374.
[2] 韩洪波， 杨春琳， 李敏杰. HPLC测定小粒种咖啡不同部位咖啡因含量[J]. 食品研究与开发， 2013， 34（6）： 85-88.
[3] ISO 20481﹕ 2008 Coffee and coffee products Determination of the caffeine content using high performance liquid chromatography（HPLC）-Reference method[S]. International Organization for Standardization， 2008.
[4] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 19182-2003/ISO 10095：1992 咖啡-咖啡因含量的测定-高效液相色谱法[S]. 北京： 中国农业出版社， 2003.
[5] 中国国家标准化管理委员会. GB/T 5009.139-2003饮料中咖啡因的测定[S]. 北京： 中国农业出版社， 2003.
[6] 李 蔚， 苏 黎，陈金东. 食品中咖啡因含量的测定方法[J]. 中国卫生检验杂志， 2008， 18（11）： 2 194-2 196.
[7] 董悦涵. 高效液相色谱法测定饮料中咖啡因含量研究[J]. 现代农业科技， 2012（6）： 280-281.
责任编辑：古小玲
关键词 咖啡及其制品；前处理；咖啡因
中图分类号 S571.2 文献标识码 A
Pretreatment Methods for Determination of Caffeine
in Coffee and Its Products by HPLC
ZOU Dongmei，YUAN Hongqiu， WU Qiong，
TANG Yongjiao， PANG Yongbo， XU Zhi
Analysis and Testing Centre， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China
Abstract Five pretreatment methods were used for five samples of coffee and its products respectively. The methods for extracting caffeine and HPLC determination of caffeine content of the samples were optimized and improved， and three new methods for caffeine determination were established. And they are accurate， rapid， safe and suitable for extracting caffeine from different samples. The results showed that the method of chloroform together with ultrasonic extraction was the best， and using this method to determine the caffeine content of FAPAS control sample showed that its caffeine content was 395.47 mg/kg， the relative error was 0.9% and the recovery rate was 100.97%. Meanwhile， the method had advantages of simple operation， less time consuming， high precision and accuracy， and it had features of wide application.
Key words Coffee and its products；Pretreatment determination methods；Caffeine content
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.031
咖啡因（caffeine）又名咖啡碱，化学名称为1，3，7，-三甲基黄嘌呤，属生物碱类化合物。它具有等刺激中枢神经作用，对神经系统、心脑血管系统、消化系统、肿瘤化疗的生化调节、神经官能症和偏头痛等均有一些积极作用[1-2]，但易上瘾。目前，测定咖啡因的方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、碘量法、重量法和分子印迹毛细管整体柱液相色谱法等，常用的方法为高效液相色谱法（HPLC）[3-7]。传统的HPLC测定前处理方法操作繁琐，且咖啡因提取率不高，导致重复性差、准确度低。为建立准确、快速、操作简便的咖啡因HPLC测定的前处理方法，本研究在现有相关标准基础上对提取测定方法进行研究和优化，比较不同前处理方法咖啡因测定结果的差异性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 待测材料 样品材料5个（表1），样品经粉碎并过25目筛后待测。
1.1.2 主要试剂和仪器 咖啡因标准品（纯度大于99.9%）购自国药集团上海化学试剂公司；Waters 高效液相色谱仪（Waters e2695，配有2489紫外检测器）。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理 样品前处理方法共5种，其中处理3～5为本研究建立的新方法，分别如下：
处理1：按照GB/T 19182-2003/ISO 10095：1992试样处理方法[3]。
处理2：按照GB/T 5009.139-2003第二法高效液相色谱法[4]。
处理3：称取样品0.5～1.0 g（精确至0.000 1 g）于150 mL的锥形瓶中，先加2～3 mL超纯水，再加50 mL三氯甲烷，加盖摇匀，在超声处理机上萃取5 min，静置30 min，分层。将萃取液移入另一250 mL的锥形瓶中，在试样中再加40 mL三氯甲烷，重复上述萃取操作步骤，弃去试样，合并2次萃取液，加入5 mL饱和氯化钠和少量无水硫酸钠（至液面无水花），过滤100 mL容量瓶中（用三氯甲烷洗锥形瓶和滤纸2次），用三氯甲烷定容至100 mL。吸取10.00 mL滤液到50 mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入10 mL容量瓶中定容。吸取1～2 mL用0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶待测（弃去前3滴）。 处理4：分别称取样品1.0 g（精确至0.000 1 g）于150 mL 的锥形瓶中，加入4.0 g氧化镁，再加入100 mL 蒸馏水，在恒温振荡水浴锅中90 ℃水浴中浸提30 min，将溶液静置，冷却至室温后过滤，滤液移入100 mL的容量瓶中，并用蒸馏水定容，稀释10倍后，取1～2 mL过0.22 μm微孔滤膜过滤至进样瓶待测（弃去前3滴）。
处理5：分别称取样品1.0 g（精确至0.000 1 g）于150 mL的锥形瓶中， 加入80 mL沸水， 加盖摇匀，在恒温振荡水浴锅中90 ℃水浴中浸提30 min，将溶液静置， 冷却至室温，然后将浸出液全部移入100 mL容量瓶中， 加入2 mL醋酸锌溶液（200 g/L）， 加入2 mL亚铁氰化钾溶液100 g/L， 摇匀， 用超纯水定容100 mL， 摇匀， 静置沉淀，过滤。准确吸取10 mL滤液至250 mL分液漏斗中，然后加入5 mL高锰酸钾溶液（15 g/L）， 摇匀， 静置5 min， 加入10 mL的亚硫酸钠（100 g/L）和硫氰酸钾（100 g/L）混合溶液（V ∶ V=1 ∶ 1），摇匀后，加入50 mL三氯甲烷。振摇100次（或2 min），静止分层并收集三氯甲烷。在水层中再加入40 mL三氯甲烷，振摇100次（或2 min），静置分层。合并2次三氯甲烷萃取液，并用三氯甲烷定容至100 mL，摇匀。吸10 mL滤液到25 mL蒸馏瓶中蒸干，用甲醇充分溶解并移入100 mL容量瓶中定容。取1 ～2 mL过0.22 μm微孔滤膜过滤至上机瓶待测（弃去最初3滴）。
1.2.2 准确度测定 参考物质测试：以表1中的样品1（参考物质）为试样，样品前处理分别按1.2.1所述5种处理方法提取咖啡因并测定其含量。每种处理方法6个重复，比较测定值的平均值与样品1（参考物质）参考值，以测定5处理种方法的准确度。
加标回收率测试：以样品1（参考物质）为试样，按1.2.1所述5处理种方法进行加标回收率试验，每种方法3个水平的加标回收，即在称取的样品中分别添加200、300、400 μg的咖啡因。依据加标量及测定值计算每种处理方法各个水平的加标回收率，以比较5种处理方法的准确度。
1.2.3 精密度及测定适用范围测定 按1.2.1所述5种前处理方法分别对4个不同咖啡因含量的样品（编号分别为2、3、4、5）进行前处理并测定咖啡因含量。每种处理方法重复做6个平行，依据测定值计算其相对标准偏差（RSD范围值≤2%），以比较5种处理方法的精密度及测定适用范围。
1.2.4 标准溶液的配制 用万分之一的电子分析天平称取咖啡因标准品40.0 mg，将其移入50 mL的容量瓶中，并用超纯水定容，即配得咖啡因标准品母液（500 μg/mL）。再用移液管精确移取0.5、1、1.5、2、3 mL 的母液，分别移入 50 mL的容量瓶中，并用超纯水定容，即得到浓度为5、10、15、20、30 μg /mL的标准品溶液。
1.2.5 色谱条件 色谱柱：Sun Fire C18 柱（4.6 mm×150 mm； 5μm）； 流动相： 甲醇 ∶ 水（V ∶ V=30 ∶ 70）； 流速： 1 mL/min；检测波长：272 nm；柱温为 35 ℃。
1.2.6 色谱测定 分别对5个样品的待测溶液进行测定，每个样品重复6次，待测样品进样6次，记录色谱图，采用外标法计算其含量。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
通过Waters 高效液相色谱仪分析建立标准样品的咖啡因色谱图（图1），咖啡因的保留时间约为4.4 min。以峰面积分值Y（μV·s）为纵坐标，标准溶液浓度X（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线（图2），计算回归方程，咖啡因标准曲线方程为：Y=2.626 78 X+1.233 13；相关系数R2=0.999 9。
2.2 5种处理方法的准确度比较
2.2.1 5种不同前处理方法的测定值与参考物质的比较 由表2可知，处理1和处理2所测定的咖啡因含量分别为132.68、216.16 mg/kg，低于对照样品，相对误差分别为45.8%、66.7%；处理3～5所测定的咖啡因含量分别为395.47、367.36、376.99 mg/kg，与对照样品相比，相对误差分别为0.9%、7.9%和5.5%，其中处理3的准确度最高。除处理1测定的咖啡因含量的RSD值<2%外，处理2～5的咖啡因含量的RSD值均小于2，说明这4种处理方法的测定精密度较高。
2.2.2 加标回收率结果 由表3可知，5种处理方法的回收率分别为39.13%、69.27%、100.97%、96.68%和94.12%，RSD值分别为1.84%、1.94%、0.60%、1.55%和1.71%，其中处理3的回收率（正常范围为80%～120%）最高，准确度也最高。
2.3 3种新前处理方法的精密度与重复性比较
分别采用处理3、4、5对样品2、3、4、5进行前处理测定咖啡因含量，精密度试验结果如表4，重复性试验结果如表5。3种处理方法的RSD值均小于2%，说明3种处理方法的精密度高。在重复性试验中，每个样品重复6次，每次重复进样6次，计算6组的咖啡因含量平均值，RSD值也均小于2，说明3种处理方法的重复性好。因此，3种前处理方法适用于不同样品的咖啡因含量测定。
2.4 5种前处理方法的综合比较
由表6可知，处理3最准确、简单、快速、安全，峰型好、杂质峰少（图3），适用于精密测定咖啡及其制品中的咖啡因的含量，处理4和5准确度较好，处理4适用大批量样品的快速测定，处理5没有杂质峰，可用于科研分析或提取纯化咖啡因。
3 讨论与结论
本研究建立了3种准确、简单、快速、安全的适合不同样品的咖啡因前处理定方法，即处理3、处理4、处理5。其测定结果明显优于目前的国家标准（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003），即处理1和处理2。主要存在以下改进： 处理3（三氯甲烷超声萃取法）在处理2的基础上进行了改进，测定方法准确、精密。该方法的超声萃取时间由处理2的1 min变为5 min，色谱条件采用GB/T 19182-2003。2013年8月，笔者参加FAPAS的能力验证（全球共73家单位参加），采用处理3提取样品2和样品3（考核样）并测定咖啡因含量，标准分数（z-score）值分别是-0.1和0.2。标准分数的绝对值小于或等于2，则通过能力验证，说明处理3测定结果的准确度高并获得国际认可。
处理4（90 ℃水浴浸提取法）在处理1的基础上进行了改进，测定方法安全、简便、高效。该方法在水浴浸提时间和纯化等方面进行改进，由处理1和国际标准（ISO 20481-2008）在恒温振荡水浴锅中90 ℃水浴中浸提20 min变为30 min，同时省去了提取液质量称重、溶液的提纯、咖啡因的吸收、脱除不需要的化合物、咖啡因的洗提等5个步骤，溶液冷却过滤后直接上机测样。但是该前处理提取的咖啡因含杂质较多，影响准确度和色谱柱的使用寿命。
处理5（90 ℃水浴中浸提，三氯甲烷萃取法）的色谱峰较纯净且准确，该方法综合了处理1和处理2，即90 ℃水浴中浸提30 min后采用GB/T 5009.139-2003中紫外分光光谱法的试样处理，但操作较繁琐。
我国农业标准一般每3～5年修订1次，但现行有效的国家标准（GB/T 19182-2003和GB/T 5009.139-2003）标龄已有10 a，它不但操作繁琐，而且在溶液提纯过程中既难操作又不经济，准确度和重复性也较差，建议有关部门尽快修订该标准。本研究中，处理1和4以90 ℃水浴浸提取，没有使用有害的有机溶剂，相对于其它3种方法的安全性更高；其余3种提取方法使用三氯甲烷（低毒，对环境有危害，对水有污染）作为提取剂，如果操作人员经过专门培训，严格遵守操作规程（密闭操作，局部排风），对人和环境不会造成明显的安全问题。三氯甲烷超声萃取法作为测定咖啡及其制品中咖啡因含量的前处理方法，其效果最佳，该方法具有操作简单、耗时少、精密度和重现性好、回收率高、测定适用范围广等特点，将为今后咖啡及其制品中咖啡因含量的测定提供技术参考。
参考文献
[1] 赵灵芝， 苏兴文， 银 巍，等. 咖啡因对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用及机制[J]. 中国药理学通报， 2004， 20（12）： 1 370-1 374.
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责任编辑：古小玲