【摘 要】
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目的 对屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)8类变应原Der p8进行克隆表达、纯化及免疫原性分析,并用生物信息学方法分析其同源性.方法 根据已知Derp8基因序列,设计PCR引物;提取屋尘螨总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到Derp8的cDNA片段,以cDNA和设计的引物进行PCR扩增;扩增产物连接至T载体并转化入大肠埃希菌(E.coli Top10)中,培养后挑选阳性单克隆菌落测序.测序正确后,转入表达载体pET-32a,经酶切鉴定、测序后转入表达
【机 构】
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深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所,深圳518073
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目的 对屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)8类变应原Der p8进行克隆表达、纯化及免疫原性分析,并用生物信息学方法分析其同源性.方法 根据已知Derp8基因序列,设计PCR引物;提取屋尘螨总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到Derp8的cDNA片段,以cDNA和设计的引物进行PCR扩增;扩增产物连接至T载体并转化入大肠埃希菌(E.coli Top10)中,培养后挑选阳性单克隆菌落测序.测序正确后,转入表达载体pET-32a,经酶切鉴定、测序后转入表达菌BL21,大量表达重组蛋白Der p 8.用亲和层析法纯化后进行免疫印迹分析(Western blotting).利用生物信息学方法分析Der p 8基因的同源性.结果 酶切鉴定显示Der p 8表达载体构建成功,目的基因分子量约为700 bp;SDS-PAGE电泳显示Der p8重组蛋白成功表达,分子量约为38 kD,且主要以包涵体形式存在.Western blotting结果显示Der p 8重组蛋白具有免疫原性.同源性分析结果显示本实验克隆Derp8基因与NCBI基因库的Derp8基因同源性为76.97％.结论 本实验成功克隆表达并纯化出具有免疫原性的Der p 8重组蛋白,为临床上应用重组蛋白于诊断和治疗提供理论基础.
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