论文部分内容阅读
摘 要：目的：对丹莲肝康颗粒中药材的提取工艺进行研究。方法：将干膏得率和丹参酮ⅡA提取率作为指标，使用均匀设计法来选择紫草醇和丹参提取工艺中的乙醇用量、乙醇的体积分数、提取的时间、浸泡时间和提取次数；将丹酚酸B和野黄岑苷的干膏得率和提取率当做指标，使用正交设计试验的方法来对整个工艺中的提取时间、浸泡时间、加水量等几个方面进行优化，从而对于最优的提取工艺进行验证。结果：最佳的提取工艺是紫草和丹参加入9.6倍的乙醇，乙醇的比例是95%，在经过了3个小时的浸泡之后，提取两次，每一次是20min，在经过了3次的验证试验之后，试验结果显示丹参酮ⅡA的提取率平均值是44.73%，而干膏得率的平均值是25.55%。将药渣和其余的一些药材也提取3次，在第一次的时候要加入12倍的水，在第2次和第3次的时候要加入10倍的水，而且每一次提取的时间是1h，在这三次验证中，野黄岑苷的平均提取率是71.67%，而丹酚酸B的平均提取率是47.67%，干膏得率的平均值是24.63%。结论：提取工业是可行的，为丹莲肝康颗粒的制备提供了科学的依据。
关键词：丹莲肝康颗粒；药材提取；丹参酮ⅡA；丹酚酸
丹莲肝康颗粒在经过一系列的临床试验得到的药物，这种药物主要是由丹参、半枝莲、鳖甲、赤芍和莪术等成分组成的，有着软坚散结、活血化瘀和清热利湿的作用，主要是用来治疗腰腿酸软、头晕耳鸣、胁下痞块、五心烦热等症状，在临床中在主要是用于肝肾阴虚型上的慢性肝炎和肝硬化。为了选择最佳的药材提取工艺，使用均匀设计法、正交试验法来进行工艺的优化。本文就是对丹莲肝康颗粒的实际应用进行详细的研究，为相关的研究提供借鉴。
1 材料
1.1 仪器
JJ300型电子天平、XS204电子分析天平、1200高效液相色谱仪和DHG型电热恒温鼓风干燥箱。
1.2 药品、药材和试剂
半枝莲、丹参、鳖甲、紫草、莪术、野黄岑苷对照品、丹参酮ⅡA对照品、丹酚酸B对照品。其中丹参酮ⅡA对照品是供含量测定使用的，丹参中含有0.42%的丹参酮ⅡA，野黄岑苷对照品的纯度是92.1%，半枝莲中含有0.24%的野黄岑苷，丹酚酸B对照品的纯度为92.1%，丹参中含有3.93%的丹酚酸B，甲醇、乙腈是色谱纯，使用的水是双蒸水，其他的试剂是分析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定
2.1.1 干膏得率的测定。要精密的吸取丹莲肝康的浓缩液，浓缩液的含量是20mL，将其放在已经干燥到恒质量的蒸发皿中，在这一状态下进行水浴蒸干，并且根据干燥失重测定法来进行相应的测定，对于干膏得率进行计算。
2.1.2 丹参酮ⅡA的测定。（1）对照品溶液在配制的过程中，要精密的进行丹参酮ⅡA对照品的称取，将其放在棕色的量瓶中，之后就可以向立面加入甲醇进行稀释，将其稀释成为1ml的溶液中含有40.2μg的丹参酮ⅡA丹参酮ⅡA溶液。（2）供试品溶液在配制的过程中，要精密的吸取丹莲肝康的浓缩液，吸取1ml，将溶液放置在50ml的量瓶中，之后就可以向里面加入45ml的甲醇，并且进行超声处理，在超声处理的过程中，功率是100w，超声频率是50kHz，超声处理的时间是15min，将其放冷加入乙醇到相应的刻度，进行摇匀和过滤处理。（3）色谱柱使用的是：EclipseXDB-C18，检测的波长是270nm，流速是1ml/min，流动相是甲醇-水，比例是80：20，进样量是10μl，柱温是25ml，y代表的是峰面积，x代表的是质量不浓度，从而达到相应的方程如下：y=25.278x+1.76，其中r为0.999，n为5，相关的结果表明了丹参酮ⅡA在质量浓度为6.4-32μg/ml这一范围内和峰面积是呈现良好的线性关系的。精密度试验RSD是0.73%的时候，根据这一结果就可以知道精密度是良好的，而供试品溶液在8h内是呈现稳定的状态的，这时RSD是0.26%，在平均加样回收率是98.23%的情况下，RSD是1.55%。根据色谱专属性试验的结果可以得知，丹参的阴性对照供试品色谱在保留的时间上是无色谱峰，也就是说明了阴性对照是无干扰的。
2.1.3 丹酚酸B的含量测定。（1）对照品溶液在配制的过程中，要精密的称取对照品适量，向里面加入甲醇，从而制成1ml中就含有282.5μg丹酚酸B的对照品溶液。（2）供试品溶液的配置。供试品溶液在配置的过程中，要精密的量取5mL的丹莲肝康的浓缩液，将其放在50mL的量瓶中，之后加入甲醇40ml，進行超声处理30min之后取出，放冷加入甲醇到相应的刻度，摇匀过滤。（3）色谱柱：EclipseXDB-C18，流动相：[甲醇-乙腈（3∶1，V/V）]-1%甲酸水溶液（38∶62，V/V），流速：1ml/min；检测波长：286nm；柱温：25℃；进样量：10μl。以峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，得回归方程：y=12.26x-142.64（r=0.99995，n=5），结果表明，丹酚酸B在22.6～282.50μg/ml质量浓度范围内与峰面呈良好的线性关系。丹酚酸B精密度试验RSD为1.61%，表明精密度良好；供试品溶液在8h内基本稳定，RSD为1.86；平均加样回收率为97.59%，RSD为1.35%。色谱专属性试验结果显示，丹参阴性对照供试品色谱在丹酚酸B对照品相应的保留时间上无色谱峰，表明阴性对照无干扰。
2.2 均匀设计法优选醇提取工艺研究
2.2.1 因素水平。根据丹参和紫草中所含有效成分的理化性质，选取乙醇体积分数（X1，%）、乙醇用量（X2，倍）、浸泡时间（X3，h）、提取时间（X4，min）、提取次数（X5）作为考察因素，以丹参酮ⅡA提取率（丹参酮ⅡA提取率%=提取液中丹参酮ⅡA总量/药材中丹参酮ⅡA总量×100%）（Y1，权重系数0.7）与干膏得率（Y2，权重系数0.3）为考察指标，采用均匀设计表来安排试验。
2.2.2 结果分析。采用DPSv6.55版数据处理系统对试验结果进行逐步回归，经F检验具有显著意义（P<0.05），表示差异具有统计学意义。从回归方程可以求得最佳参数为：取处方量的丹参和紫草，加9.6倍量95%的乙醇，浸泡3h，提取2次，每次提取20min。
2.3 正交设计试验法优选水提工艺研究
选取提取次数（A）、提取时间（B，min）、加水量（C，倍）作为考察因素，进行L9（34）正交试验，以丹酚酸B提取率[丹酚酸B提取率（%）=提取液中丹酚酸B总量/药材中丹酚酸B总量×100%]（Y3，权重系数0.4）、野黄芩苷提取率[野黄芩苷提取率%=提取液中野黄芩苷总量/药材中野黄芩苷总量×100%]（Y4，权重系数0.4）和干膏得率（Y5，权重系数0.2）为考察指标综合评价，筛选最佳工艺。
结果：方差分析结果表明，提取次数和提取时间均对提取结果有显著影响（P<0.05），而加水倍量对结果无显著影响。
3 讨论
均匀设计可以将试验有关因素的各水平数均匀分散在实验范围内，尤其适合中药处方筛选、提取工艺优化等经常涉及多因素、多水平的试验，以丹酚酸B和野黄芩苷的提取率及干膏得率为考察指标，采用多指标归一化加权法，综合评价优选丹莲肝康颗粒的水提取工艺。综上所述，本研究中醇提工艺验证结果与优选结果基本吻合，表明优选的工艺合理、工艺条件稳定可行。
参考文献
[1]许梦寒，农毅清，蒋林.多指标正交试验优选保健食品蓝参降脂咀嚼片醇提工艺[J].中国药师，2014，17（3）：366.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：71、附录51.
[3]赵向阳，沈静，刘峰，等.RP-HPLC法测定复方半支莲胶囊中野黄芩苷含量[J].安徽医药，2005，9（5）：348.
关键词：丹莲肝康颗粒；药材提取；丹参酮ⅡA；丹酚酸
丹莲肝康颗粒在经过一系列的临床试验得到的药物，这种药物主要是由丹参、半枝莲、鳖甲、赤芍和莪术等成分组成的，有着软坚散结、活血化瘀和清热利湿的作用，主要是用来治疗腰腿酸软、头晕耳鸣、胁下痞块、五心烦热等症状，在临床中在主要是用于肝肾阴虚型上的慢性肝炎和肝硬化。为了选择最佳的药材提取工艺，使用均匀设计法、正交试验法来进行工艺的优化。本文就是对丹莲肝康颗粒的实际应用进行详细的研究，为相关的研究提供借鉴。
1 材料
1.1 仪器
JJ300型电子天平、XS204电子分析天平、1200高效液相色谱仪和DHG型电热恒温鼓风干燥箱。
1.2 药品、药材和试剂
半枝莲、丹参、鳖甲、紫草、莪术、野黄岑苷对照品、丹参酮ⅡA对照品、丹酚酸B对照品。其中丹参酮ⅡA对照品是供含量测定使用的，丹参中含有0.42%的丹参酮ⅡA，野黄岑苷对照品的纯度是92.1%，半枝莲中含有0.24%的野黄岑苷，丹酚酸B对照品的纯度为92.1%，丹参中含有3.93%的丹酚酸B，甲醇、乙腈是色谱纯，使用的水是双蒸水，其他的试剂是分析纯。
2 方法与结果
2.1 含量测定
2.1.1 干膏得率的测定。要精密的吸取丹莲肝康的浓缩液，浓缩液的含量是20mL，将其放在已经干燥到恒质量的蒸发皿中，在这一状态下进行水浴蒸干，并且根据干燥失重测定法来进行相应的测定，对于干膏得率进行计算。
2.1.2 丹参酮ⅡA的测定。（1）对照品溶液在配制的过程中，要精密的进行丹参酮ⅡA对照品的称取，将其放在棕色的量瓶中，之后就可以向立面加入甲醇进行稀释，将其稀释成为1ml的溶液中含有40.2μg的丹参酮ⅡA丹参酮ⅡA溶液。（2）供试品溶液在配制的过程中，要精密的吸取丹莲肝康的浓缩液，吸取1ml，将溶液放置在50ml的量瓶中，之后就可以向里面加入45ml的甲醇，并且进行超声处理，在超声处理的过程中，功率是100w，超声频率是50kHz，超声处理的时间是15min，将其放冷加入乙醇到相应的刻度，进行摇匀和过滤处理。（3）色谱柱使用的是：EclipseXDB-C18，检测的波长是270nm，流速是1ml/min，流动相是甲醇-水，比例是80：20，进样量是10μl，柱温是25ml，y代表的是峰面积，x代表的是质量不浓度，从而达到相应的方程如下：y=25.278x+1.76，其中r为0.999，n为5，相关的结果表明了丹参酮ⅡA在质量浓度为6.4-32μg/ml这一范围内和峰面积是呈现良好的线性关系的。精密度试验RSD是0.73%的时候，根据这一结果就可以知道精密度是良好的，而供试品溶液在8h内是呈现稳定的状态的，这时RSD是0.26%，在平均加样回收率是98.23%的情况下，RSD是1.55%。根据色谱专属性试验的结果可以得知，丹参的阴性对照供试品色谱在保留的时间上是无色谱峰，也就是说明了阴性对照是无干扰的。
2.1.3 丹酚酸B的含量测定。（1）对照品溶液在配制的过程中，要精密的称取对照品适量，向里面加入甲醇，从而制成1ml中就含有282.5μg丹酚酸B的对照品溶液。（2）供试品溶液的配置。供试品溶液在配置的过程中，要精密的量取5mL的丹莲肝康的浓缩液，将其放在50mL的量瓶中，之后加入甲醇40ml，進行超声处理30min之后取出，放冷加入甲醇到相应的刻度，摇匀过滤。（3）色谱柱：EclipseXDB-C18，流动相：[甲醇-乙腈（3∶1，V/V）]-1%甲酸水溶液（38∶62，V/V），流速：1ml/min；检测波长：286nm；柱温：25℃；进样量：10μl。以峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，得回归方程：y=12.26x-142.64（r=0.99995，n=5），结果表明，丹酚酸B在22.6～282.50μg/ml质量浓度范围内与峰面呈良好的线性关系。丹酚酸B精密度试验RSD为1.61%，表明精密度良好；供试品溶液在8h内基本稳定，RSD为1.86；平均加样回收率为97.59%，RSD为1.35%。色谱专属性试验结果显示，丹参阴性对照供试品色谱在丹酚酸B对照品相应的保留时间上无色谱峰，表明阴性对照无干扰。
2.2 均匀设计法优选醇提取工艺研究
2.2.1 因素水平。根据丹参和紫草中所含有效成分的理化性质，选取乙醇体积分数（X1，%）、乙醇用量（X2，倍）、浸泡时间（X3，h）、提取时间（X4，min）、提取次数（X5）作为考察因素，以丹参酮ⅡA提取率（丹参酮ⅡA提取率%=提取液中丹参酮ⅡA总量/药材中丹参酮ⅡA总量×100%）（Y1，权重系数0.7）与干膏得率（Y2，权重系数0.3）为考察指标，采用均匀设计表来安排试验。
2.2.2 结果分析。采用DPSv6.55版数据处理系统对试验结果进行逐步回归，经F检验具有显著意义（P<0.05），表示差异具有统计学意义。从回归方程可以求得最佳参数为：取处方量的丹参和紫草，加9.6倍量95%的乙醇，浸泡3h，提取2次，每次提取20min。
2.3 正交设计试验法优选水提工艺研究
选取提取次数（A）、提取时间（B，min）、加水量（C，倍）作为考察因素，进行L9（34）正交试验，以丹酚酸B提取率[丹酚酸B提取率（%）=提取液中丹酚酸B总量/药材中丹酚酸B总量×100%]（Y3，权重系数0.4）、野黄芩苷提取率[野黄芩苷提取率%=提取液中野黄芩苷总量/药材中野黄芩苷总量×100%]（Y4，权重系数0.4）和干膏得率（Y5，权重系数0.2）为考察指标综合评价，筛选最佳工艺。
结果：方差分析结果表明，提取次数和提取时间均对提取结果有显著影响（P<0.05），而加水倍量对结果无显著影响。
3 讨论
均匀设计可以将试验有关因素的各水平数均匀分散在实验范围内，尤其适合中药处方筛选、提取工艺优化等经常涉及多因素、多水平的试验，以丹酚酸B和野黄芩苷的提取率及干膏得率为考察指标，采用多指标归一化加权法，综合评价优选丹莲肝康颗粒的水提取工艺。综上所述，本研究中醇提工艺验证结果与优选结果基本吻合，表明优选的工艺合理、工艺条件稳定可行。
参考文献
[1]许梦寒，农毅清，蒋林.多指标正交试验优选保健食品蓝参降脂咀嚼片醇提工艺[J].中国药师，2014，17（3）：366.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：71、附录51.
[3]赵向阳，沈静，刘峰，等.RP-HPLC法测定复方半支莲胶囊中野黄芩苷含量[J].安徽医药，2005，9（5）：348.