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[摘要]目的：研究紫草素对正常人表皮黑素细胞黑素合成的影响，及对紫外线辐射后黑素细胞黑素合成的影响。方法：用体外培养正常人表皮黑素细胞供给实验，黑素细胞经10mJ/cm2外线辐射后，分别以选定的几个浓度（主要为0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L三种浓度）的紫草素培养72h，测定细胞增殖率、黑素含量及酪氨酸酶活性。结果：紫草素可减轻紫外线辐射对细胞增殖的抑制作用，并可抑制紫外线辐射后的表皮黑素细胞的黑素合成；较高浓度紫草素（大于0.5ug/L）对未经照射的表皮黑素细胞的增殖有抑制作用，但对黑素合成无明显影响。结论：紫草素可以明显抑制紫外线辐射后表皮黑素细胞的黑素合成，推测其对紫外线辐射的黑素细胞有光保护作用。
[关键词]紫草素；黑素细胞；黑素合成；酪氨酸酶；紫外线辐射；光保护
[中图分类号]R339.3 8
[文献标志码]A
[文章编号]1008-6455（2017）01-0088-03
色素增加性皮肤病如黄褐斑、炎症后色素沉着等一直是皮肤科比较常见的疾病，紫外线辐射可以加重或者诱发色素沉着发生的问题已经越来越受到重视，随着人们生活水平的提高，美白外用疗法及对防晒产品的研究渐渐成为热点。紫草含具有多种生物活性的有效成分，主要包括萘醌类化合物左旋紫草素及其衍生物，其有抗炎作用，抗病原微生物作用，抗癌作用，抗生育作用，抗氧化作用等。姜爱莉等人则报道了紫草中的抗氧化化学成分，发现其有很强的抗氧化活性，是一种有开发前途的抗氧化剂。作为一种强抗氧化剂，紫草对黑素细胞的光保护作用，目前却没有相关的报道，笔者基于此，进行了以下相关研究。
1.材料和方法
1.1材料：二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、分离酶（dispase）、MCDBl53培养基、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购自Sigma公司；小牛血清、胎牛血清、1640培养基、青链霉素混合液、左旋多巴、TritonX 100购自Hyclone公司；细胞因子（NGF，FGF，ET1）购自Sino Biological公司；紫草素由中国人民解放军309医院皮肤科惠赠；以DMSO配制成50ug/L的贮存液，-80°C冰箱保存，使用前稀释至工作浓度。25cm2塑料培养瓶，96孔培养板为美国Corning公司产品；GS-2004日光模擬器（北京澳华公司），紫外分光光度计（上海精密分析仪器有限公司），光辐照度计量仪SUV 5（中国计量科学院）；Therm0371型二氧化碳培养箱，Eppendorf微量移液器，Leica倒置显微镜，无菌工作台等。
1.2方法
1.2.1细胞培养：取泌尿外科包皮环切术后的分离体做标本，碘伏浸泡15min，PBS冲洗3遍，眼科剪去除皮下脂肪组织及微小血管，将组织剪成1cm×1cm的小块，加入0.5%分离酶至液体完全覆盖组织，放置4℃过夜使真皮表皮充分分离，眼科镊小心分离表真皮，将表皮置于0.25%的胰酶中37℃消化5～10min，显微镜观察消化情况良好后加入3～5ml含新生牛血清的1640培养液终止消化，轻轻吹打细胞悬液，使细胞分散，200目滤网过滤，2000rpm离心5min，弃掉上清液后加入配制好的黑素细胞培养基，吹打使细胞悬浮，计数并调节合适的细胞浓度，接种到25cm2的培养瓶中（接种密度为105个细胞/cm2），常规培养换液，细胞生长至80%融合时传代，取传代2代～3代纯化的黑素细胞用于实验。细胞接种24h后，根据实验分组对细胞进行干预处理。
黑素细胞的鉴定：采取HMB45单抗免疫组化和FontanaMasson染色方法对黑素细胞进行鉴定。
1.2.2紫外线照射：GS-2004日光模拟器能够模拟自然紫外线照射，根据文献选定紫外线照射剂量为10mJ/cm2，照射强度为1mw/cm2，光源距离培养板20cm垂直照射，照射前将培养基换为0.1M灭菌的PBS，照射后换回相应的培养基。
1.2.3药物配制和实验分组：使用DMSO配制紫草素母液，浓度为50ug/L，-80℃保存，用前再用新鲜培养基调至终浓度。經预实验选用紫草素的终浓度为0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L。
实验分组分别为空白对照组（仅加入等量相应溶媒）、紫草素组（浓度分别为0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L）、紫外线辐射组、紫外线辐射+紫草素组（0.25ug/L、0.5ug/L 2个浓度）、阳性对照组（紫外线辐射+20ug/ml维生素c）。每一处理组分别作用细胞72h。
1.2.4MTT法测定细胞增殖率：用酶标仪测定吸光度A490nm值。细胞增值率以处理组A490/空白对照组A490的百分率来表示。
1.2.5黑素含量测定：NaOH裂解法测黑素含量，参照文献的方法稍做改良，用分光光度计测定黑素的吸光度（A470nm）。黑素含量以（处理组A470/细胞数）/（空白对照组A470/细胞数）×100来表示。每一实验重复4次。
1.2.6酪氨酸酶活性测定：参照文献采用多巴氧化法，分光光度计测定黑素的吸光度值（A475nm）。酪氨酸酶活性以（处理组A475值/细胞数）/（空白对照组A475值/细胞数）×100来表示。每一实验重复4次。
1.2.7数据处理：各组数据用x±s表示。采用SPSS13.0统计软件进行组问单因素方差分析，以P<0.05为有统计学意义。
2.结果
2.1对黑素细胞增殖率的影响：与空白对照组相比，紫草素浓度为0.25ug/L时，对黑素细胞的增殖没有影响（P>0.05），紫草素浓度在0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L时对黑素细胞增殖率随着浓度的增加而下降并有统计学差异（P<0.05）（图1）；紫外线（10mJ/cm2）照射后细胞增殖率降低（P<0.05），紫外线照射+紫草素组（浓度为0.25ug/L、0.5ug/L）与照射组相比，细胞增殖有明显增加（P<0.05）。 2.2对黑素含量的影响：根据上述对黑素细胞增值率的影响结果及有關文獻。的报道，我们选择了0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L三种浓度的紫草素来进行实验，结果显示：与空白对照组相比较，上述三种浓度的紫草素对黑素含量无影响（P>0.05）；紫外线照射可以明显增加黑素含量（P<0.05），但紫外线辐射+紫草素（0.25ug/L，0.5ug/L）后，与单纯紫外线辐射组相比较，黑素含量有所下降，统计学结果显示有显著差异（P<0.05）（图2）。20ug/mL维生素c也有一定程度抑制紫外线辐射后黑素细胞黑素合成增加的作用，但与紫外线辐射组比较无明显差异（P>0.05）。
2.3对酪氨酸酶活性的影响：紫草素组（0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L）与对照组比较，其对黑素细胞的酪氨酸酶活性无影响（P>0.05），紫外线照射可明显增加酪氨酸酶活性（P<0.05）。与紫外线辐射组比较，加0.25ug/L紫草素和0.5ug/L紫草素组可明显降低细胞内酪氨酸酶活性（P<0.05）；20ug/ml维生素c组对紫外线辐射后细胞内酪氨酸酶活性无明显影响（P>0.05）（见图3）。
3.讨论
紫草的有效成分主要有以下两大类：一类是脂溶性的萘醌类色素，包括紫草素（sh ikonin），乙酰紫草素（acetylshikonin），β，β二甲基丙烯酰紫草素（i sobuthyl2shikonin），β羟基异戊酰紫草素（β-hydaroxyi sovalerylshikonin），异戊酰紫草素（isovaleryl shikonin），去氧紫草素（deoxy shikonin）等；另一类是水溶性的多糖成分，含量在2%左右。萘醌类色素的主要药理作用除了抗炎作用、抗病原微生物作用、抗癌作用、抗生育作用、保肝作用以外，还有抗凝血、抗免疫缺陷、抗前列腺素合成、抗真菌以及清除活性氧作用等。
本试验结果提示：紫草素在对黑素细胞增殖率影响不大（>83%）的浓度下（0.25ug/L、0.5ug/L）可以明显抑制经紫外线辐射后的黑素细胞的黑素合成，但对正常黑素细胞的黑素合成无影响。这与以前的相关研究有差异，笔者分析这可能与选择培养的细胞株不同有关，也与培养细胞的所处状态不同有关，共培养体系中的黑素细胞与纯化的单一黑素细胞对紫草素的反应是可以不同的，因为角质形成细胞可以通过分泌细胞因子来调节黑素细胞的功能。在以前的研究中，王威，刘婷等表明，紫草素以及紫草多糖都具有一定的抗氧化活性。其中紫草素的抗氧化能力相当于维生素c的35.5%，其抗氧化作用主要由于其醌结构中在5位和8位上具有对应酚羟基决定的。基于此，我们推测紫草素对紫外线辐射后的黑素细胞会有保护作用并设计了本研究，实验结果证实了在不影响黑素细胞增殖率的浓度下（0.25ug/L）及影响不大的浓度下（0.5ug/L），紫草素可以明显地抑制紫外线辐射后黑素细胞的黑素合成及酪氨酸酶活性，其光保护作用得到了证实。另有研究表明，复方紫草油外用于烧伤创面可以使局部ET-1和NO释放减少，两者比例更趋于协调，从而使创面微血管的收缩痉挛状态减轻，组织缺血状态得到缓解，自由基生成减少，最后达到抗炎的效果。而且早有实验证实活性氧自由基（ROs）与一氧化氮（NO）均具有很强的刺激黑素细胞黑素合成作用，紫外线辐射可诱导二者的产生，这也是紫外线促进黑素合成的重要原因之一。因此我们推测紫草素可能通过抑制上述物质的产生来发挥其光保护作用，这值得我们进一步探讨和研究。
[关键词]紫草素；黑素细胞；黑素合成；酪氨酸酶；紫外线辐射；光保护
[中图分类号]R339.3 8
[文献标志码]A
[文章编号]1008-6455（2017）01-0088-03
色素增加性皮肤病如黄褐斑、炎症后色素沉着等一直是皮肤科比较常见的疾病，紫外线辐射可以加重或者诱发色素沉着发生的问题已经越来越受到重视，随着人们生活水平的提高，美白外用疗法及对防晒产品的研究渐渐成为热点。紫草含具有多种生物活性的有效成分，主要包括萘醌类化合物左旋紫草素及其衍生物，其有抗炎作用，抗病原微生物作用，抗癌作用，抗生育作用，抗氧化作用等。姜爱莉等人则报道了紫草中的抗氧化化学成分，发现其有很强的抗氧化活性，是一种有开发前途的抗氧化剂。作为一种强抗氧化剂，紫草对黑素细胞的光保护作用，目前却没有相关的报道，笔者基于此，进行了以下相关研究。
1.材料和方法
1.1材料：二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、分离酶（dispase）、MCDBl53培养基、四甲基偶氮唑蓝（MTT）均购自Sigma公司；小牛血清、胎牛血清、1640培养基、青链霉素混合液、左旋多巴、TritonX 100购自Hyclone公司；细胞因子（NGF，FGF，ET1）购自Sino Biological公司；紫草素由中国人民解放军309医院皮肤科惠赠；以DMSO配制成50ug/L的贮存液，-80°C冰箱保存，使用前稀释至工作浓度。25cm2塑料培养瓶，96孔培养板为美国Corning公司产品；GS-2004日光模擬器（北京澳华公司），紫外分光光度计（上海精密分析仪器有限公司），光辐照度计量仪SUV 5（中国计量科学院）；Therm0371型二氧化碳培养箱，Eppendorf微量移液器，Leica倒置显微镜，无菌工作台等。
1.2方法
1.2.1细胞培养：取泌尿外科包皮环切术后的分离体做标本，碘伏浸泡15min，PBS冲洗3遍，眼科剪去除皮下脂肪组织及微小血管，将组织剪成1cm×1cm的小块，加入0.5%分离酶至液体完全覆盖组织，放置4℃过夜使真皮表皮充分分离，眼科镊小心分离表真皮，将表皮置于0.25%的胰酶中37℃消化5～10min，显微镜观察消化情况良好后加入3～5ml含新生牛血清的1640培养液终止消化，轻轻吹打细胞悬液，使细胞分散，200目滤网过滤，2000rpm离心5min，弃掉上清液后加入配制好的黑素细胞培养基，吹打使细胞悬浮，计数并调节合适的细胞浓度，接种到25cm2的培养瓶中（接种密度为105个细胞/cm2），常规培养换液，细胞生长至80%融合时传代，取传代2代～3代纯化的黑素细胞用于实验。细胞接种24h后，根据实验分组对细胞进行干预处理。
黑素细胞的鉴定：采取HMB45单抗免疫组化和FontanaMasson染色方法对黑素细胞进行鉴定。
1.2.2紫外线照射：GS-2004日光模拟器能够模拟自然紫外线照射，根据文献选定紫外线照射剂量为10mJ/cm2，照射强度为1mw/cm2，光源距离培养板20cm垂直照射，照射前将培养基换为0.1M灭菌的PBS，照射后换回相应的培养基。
1.2.3药物配制和实验分组：使用DMSO配制紫草素母液，浓度为50ug/L，-80℃保存，用前再用新鲜培养基调至终浓度。經预实验选用紫草素的终浓度为0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L。
实验分组分别为空白对照组（仅加入等量相应溶媒）、紫草素组（浓度分别为0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L）、紫外线辐射组、紫外线辐射+紫草素组（0.25ug/L、0.5ug/L 2个浓度）、阳性对照组（紫外线辐射+20ug/ml维生素c）。每一处理组分别作用细胞72h。
1.2.4MTT法测定细胞增殖率：用酶标仪测定吸光度A490nm值。细胞增值率以处理组A490/空白对照组A490的百分率来表示。
1.2.5黑素含量测定：NaOH裂解法测黑素含量，参照文献的方法稍做改良，用分光光度计测定黑素的吸光度（A470nm）。黑素含量以（处理组A470/细胞数）/（空白对照组A470/细胞数）×100来表示。每一实验重复4次。
1.2.6酪氨酸酶活性测定：参照文献采用多巴氧化法，分光光度计测定黑素的吸光度值（A475nm）。酪氨酸酶活性以（处理组A475值/细胞数）/（空白对照组A475值/细胞数）×100来表示。每一实验重复4次。
1.2.7数据处理：各组数据用x±s表示。采用SPSS13.0统计软件进行组问单因素方差分析，以P<0.05为有统计学意义。
2.结果
2.1对黑素细胞增殖率的影响：与空白对照组相比，紫草素浓度为0.25ug/L时，对黑素细胞的增殖没有影响（P>0.05），紫草素浓度在0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L时对黑素细胞增殖率随着浓度的增加而下降并有统计学差异（P<0.05）（图1）；紫外线（10mJ/cm2）照射后细胞增殖率降低（P<0.05），紫外线照射+紫草素组（浓度为0.25ug/L、0.5ug/L）与照射组相比，细胞增殖有明显增加（P<0.05）。 2.2对黑素含量的影响：根据上述对黑素细胞增值率的影响结果及有關文獻。的报道，我们选择了0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L三种浓度的紫草素来进行实验，结果显示：与空白对照组相比较，上述三种浓度的紫草素对黑素含量无影响（P>0.05）；紫外线照射可以明显增加黑素含量（P<0.05），但紫外线辐射+紫草素（0.25ug/L，0.5ug/L）后，与单纯紫外线辐射组相比较，黑素含量有所下降，统计学结果显示有显著差异（P<0.05）（图2）。20ug/mL维生素c也有一定程度抑制紫外线辐射后黑素细胞黑素合成增加的作用，但与紫外线辐射组比较无明显差异（P>0.05）。
2.3对酪氨酸酶活性的影响：紫草素组（0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L）与对照组比较，其对黑素细胞的酪氨酸酶活性无影响（P>0.05），紫外线照射可明显增加酪氨酸酶活性（P<0.05）。与紫外线辐射组比较，加0.25ug/L紫草素和0.5ug/L紫草素组可明显降低细胞内酪氨酸酶活性（P<0.05）；20ug/ml维生素c组对紫外线辐射后细胞内酪氨酸酶活性无明显影响（P>0.05）（见图3）。
3.讨论
紫草的有效成分主要有以下两大类：一类是脂溶性的萘醌类色素，包括紫草素（sh ikonin），乙酰紫草素（acetylshikonin），β，β二甲基丙烯酰紫草素（i sobuthyl2shikonin），β羟基异戊酰紫草素（β-hydaroxyi sovalerylshikonin），异戊酰紫草素（isovaleryl shikonin），去氧紫草素（deoxy shikonin）等；另一类是水溶性的多糖成分，含量在2%左右。萘醌类色素的主要药理作用除了抗炎作用、抗病原微生物作用、抗癌作用、抗生育作用、保肝作用以外，还有抗凝血、抗免疫缺陷、抗前列腺素合成、抗真菌以及清除活性氧作用等。
本试验结果提示：紫草素在对黑素细胞增殖率影响不大（>83%）的浓度下（0.25ug/L、0.5ug/L）可以明显抑制经紫外线辐射后的黑素细胞的黑素合成，但对正常黑素细胞的黑素合成无影响。这与以前的相关研究有差异，笔者分析这可能与选择培养的细胞株不同有关，也与培养细胞的所处状态不同有关，共培养体系中的黑素细胞与纯化的单一黑素细胞对紫草素的反应是可以不同的，因为角质形成细胞可以通过分泌细胞因子来调节黑素细胞的功能。在以前的研究中，王威，刘婷等表明，紫草素以及紫草多糖都具有一定的抗氧化活性。其中紫草素的抗氧化能力相当于维生素c的35.5%，其抗氧化作用主要由于其醌结构中在5位和8位上具有对应酚羟基决定的。基于此，我们推测紫草素对紫外线辐射后的黑素细胞会有保护作用并设计了本研究，实验结果证实了在不影响黑素细胞增殖率的浓度下（0.25ug/L）及影响不大的浓度下（0.5ug/L），紫草素可以明显地抑制紫外线辐射后黑素细胞的黑素合成及酪氨酸酶活性，其光保护作用得到了证实。另有研究表明，复方紫草油外用于烧伤创面可以使局部ET-1和NO释放减少，两者比例更趋于协调，从而使创面微血管的收缩痉挛状态减轻，组织缺血状态得到缓解，自由基生成减少，最后达到抗炎的效果。而且早有实验证实活性氧自由基（ROs）与一氧化氮（NO）均具有很强的刺激黑素细胞黑素合成作用，紫外线辐射可诱导二者的产生，这也是紫外线促进黑素合成的重要原因之一。因此我们推测紫草素可能通过抑制上述物质的产生来发挥其光保护作用，这值得我们进一步探讨和研究。