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为优化酶解法制备绵羊乳酪蛋白ACE抑制肽的工艺条件以及筛选和鉴定一种新的ACE抑制肽，选用5种蛋白酶水解酪蛋白，以水解度、分子质量分布和ACE抑制率为指标筛选最适蛋白酶，采用单因素和响应面试验优化工艺，采用三合一质谱仪（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS）方法鉴定分子质量小于3ku组分的氨基酸序列，筛选潜在ACE抑制肽，进行人工合成，测定其IC50值。采用Linewaver-Burk作图确定酶抑制动力学，结合分子对接解析肽段的抑制机制。结果表明：碱性蛋白酶水解酪蛋白的最佳条件为pH 6、底物含量8%、酶添加量4%、温度55℃、水解时间90 min，此时酪蛋白水解液ACE抑制率为99.1%。验证具有ACE抑制活性的肽段10条，筛选出一条新颖的降血压肽——LFRQFY(源自αs1-酪蛋白)，其ACE抑制活性的IC50为（7.9±1.7）μmol/L，酶抑制动力学为混合抑制模式。分子对接结果表明：LFRQFY能与ACE的氨基酸残基Ala354（活性口袋S1）、His353（活性口袋S2）形成氢键，具有显著的体外降血压活性。