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摘要：本文通过对流动相、色谱柱、检测波长法的选择确定了最佳的分离条件，具有较好的准确度和精密度。
关键词：高效液相色谱； 碱性紫5BN ；色谱分析
1. 前言
碱性紫5BN是目前碱性染料的主要产品之一，由于其制造工艺的特殊性，厂家的合成工艺各异，产品产物和副产物有所差异，使碱性紫5BN 的主要成分所占比例不同，对产品的质量影响甚大，故通过对其分析使其质量符合国家标准显得尤为重要。本课题主要研究用高效液相色谱法对碱性紫5BN进行分析检测，并进行优化。
2.碱性紫5BN的性质及组成
碱性紫 5BN俗名盐基青莲，是一种三苯甲烷型碱性染料， 外观呈深绿色粉末， 微臭，溶于热水后呈紫色，主要含有五甲基衍生物，也常含有四甲基和六甲基衍生物，所以碱性紫是这些三苯甲基衍生物的混合物[1]，它的分子式为C25H30ClN3。
3.碱性紫5BN的分析方法
碱性紫5BN的分析方法主要有高效液相色谱分析法和紫外分光光度法，前者从控制PH着手，对产品主成分进行测定，对碱性紫5BN粗制品和成品分析均适用，后者具有快速、方便、省时、准确等优点，可作为医院制剂质量控制的一种方法[2]。
4.实验部分
4.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪：Waters510泵； 484检测器；色谱工作站： Echr om 98 。
甲醇：色谱纯；蒸馏水：经 0 .45 μm滤膜过滤； 碱性紫5BN标准品；碱性紫5BN样品；分析天平 （感量： 0.01mg） ；定量环：10 μL；玻璃注射器： 0.25mL。
4.2 色谱分析条件
色谱柱： 150mm ×416mm i1d （Spherisorb C18） ；流动相：甲醇 +水 = 70 + 30 ；
流速： 0.8mL /min；波长： 280nm；进样量： 10μL。
4.3 标准品及样品的制备
4.3.1 标准溶液的配制
准确称取碱性紫 5BN标准品0.0095g ， 碱性紫6BN 标准品0.0106g ，分别用少量流动相溶解，并定容于50mL 容量瓶中，于超声波发生器中震荡10 min 后冷却至室温，配制成0.190mg/ mL 、0.212mg/ mL的标准溶液。
4.3.2 样品溶液的配制
用十万分之一的分析天平称量碱性紫5BN样品 0.00461g ，用少量流动相溶解并定容于100mL的容量瓶中， 于超声波发生器中震荡10 min 后冷却至室温，用0.45 μm 孔径滤膜过滤，配制成0.0461mg/ mL 的样品溶液，冷藏备用。
4.4 测定步骤
待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻两面积相对变化均小于1.5%后，按标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。开机预热 ，仪器运行稳定后 ，用微量注射器分别吸取标准溶液和样品溶液依次注入并充满进样阀 ，待最后一个组分流出完毕 ，用数据处理机进行结果处理。
4.5 结果与讨论
4.5.1 检测波长的选择
碱性紫5BN和碱性紫6BN具有较大的共轭体系[3]，在可见区具有强烈的光吸收，碱性紫5BN 的最大吸收波长是580nm ，碱性紫6BN的最大吸收波长是557nm ，本文选用580nm为检测波长。
4.5.2 pH 值的选择
流动相pH 值的大小对碱性紫5BN和碱性紫6BN的保留时间、分离度有较大的影响。当pH 值小于5.5 时，碱性紫5BN和碱性紫6BN色谱峰重叠；pH 值大于5. 5 时，随着pH 值增大分离度逐渐改善，碱性紫5BN的保留时间也逐渐增加。为了缩短分离时间，同时又不至于使过强的碱性对色谱柱造成不利影響，选择pH 值为6.0较为合适。
4.5.3流动相的选择
用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法，即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法，即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加[4]。本试验采用梯度洗脱法，选择流动相溶解样品，碱性紫5BN不与流动相发生反应，对比样品与标样波长扫描图，对应的碱性紫5BN与碱性紫6BN完全一致。通过比较实验， 发现采用Spherisorb C18 色谱柱，以甲醇∶水= 7∶3为流动相 ，此时碱性紫5BN和碱性紫6BN及其它杂质得到很好的分离。
4.5.4 标准曲线的制作
以进样量（mg） 为横坐标（ x ） ， 峰面积为纵坐标（ y） ，作碱性紫6BN和碱性紫6BN标准曲线，结果分别为y =7988.1x - 5483.3（线性范围19.0～1140），y =6897.4x - 29522.5（线性范围21.2～1060） 。相关系数为0.9998和0.9997，可见， 碱性紫6BN和碱性紫6BN 的线性关系良好，线性范围较宽。
4.5.5 样品的含量及精密度
将配制好的0. 0461mg/ mL 的样品溶液在4.2的条件下进样20μL ，重复6 次，测定峰面积。碱性紫5BN峰面积平均值是7599250 ， 碱性紫6BN峰面积的平均值是405210 ，将峰面积分别代入表2 中各自的标准工作曲线方程， 求得碱性紫 5BN为85715mg ， 碱性紫6BN为58.1mg ，计算出各自的质量分数。碱性紫5BN % =857.5mg/（0.0461mg/ mL ×1000 ×20μL）= 93.0 %，同理求得碱性紫6BN质量分数是6.3 %。
通过峰面积的六次测定值求得碱性紫5BN 的变异系数是0.97 % ， 碱性紫6BN的变异系数是1.31 % ，由以上变异系数的数值说明，本方法重现性良好。
4.5.6 回收率的测定
在工业品碱性紫5BN的样品溶液中分别加入三种不同量的碱性紫5BN和碱性紫6BN的标准品。测定峰面积，取其算术平均值，并减去工业品碱性紫5BN样品中原有的碱性紫5BN和碱性紫6BN的峰面积，计算新增加的碱性紫5BN和碱性紫6BN的含量，然后计算出其回收率分别为99.6%和100.8%。
实验结果表明，分析试样中加入不同量的标准样品后，计算值与测定值基本相符，平均回收率接近于100% ，说明本方法准确度高，可靠性强。
4.5.7 检出限的测定
本文采用逐渐稀释的方法，以二倍信噪比计算检出限。碱性紫5BN的检出限是0.76mg，碱性紫6BN的检出限是0.27mg。
4.5.8 结论
采用高效液相色谱法 ，色谱条件：甲醇 +水 = 70+ 30 （ pH = 5.5～6.0）为流动相在C18柱上分析碱性紫5BN 、碱性紫6BN都能得到很好的分离。可以一次完成对碱性紫5BN及所含主要有机杂质的定量测试 ，适用于工业生产的质量控制 ，并对生产有一定的指导意义。
5.总结
本文提出的碱性紫5BN的高效液相色谱分析法，有较高的精密度和准确度，且操作简便 ，分析时间较短 ，是企业工业化生产时进行产品检验较为理想的分析方法。
参考文献
[1] 高林柏.生产碱性紫的非酚新工艺[J].江苏省扬州染料化工.2001，（04）：64.
[2]陈金全，荣林.紫外分光光度法测定甲紫溶液含量[J].《山东医药工业》，2003（03）：17-19.
[3]李春秋，朱殿奎，吴俊明.湿法合成红光碱性紫（5BN）染料[J].杨州师范学院：17-18.
[4]邹汗法，张玉奎，卢佩章.高效液相色谱法[M].科学出版社，2001.
蔡秀丽（1986---），女 ，江西龙南人，大学本科，应用化学专业，作者研究方向：环境保护
关键词：高效液相色谱； 碱性紫5BN ；色谱分析
1. 前言
碱性紫5BN是目前碱性染料的主要产品之一，由于其制造工艺的特殊性，厂家的合成工艺各异，产品产物和副产物有所差异，使碱性紫5BN 的主要成分所占比例不同，对产品的质量影响甚大，故通过对其分析使其质量符合国家标准显得尤为重要。本课题主要研究用高效液相色谱法对碱性紫5BN进行分析检测，并进行优化。
2.碱性紫5BN的性质及组成
碱性紫 5BN俗名盐基青莲，是一种三苯甲烷型碱性染料， 外观呈深绿色粉末， 微臭，溶于热水后呈紫色，主要含有五甲基衍生物，也常含有四甲基和六甲基衍生物，所以碱性紫是这些三苯甲基衍生物的混合物[1]，它的分子式为C25H30ClN3。
3.碱性紫5BN的分析方法
碱性紫5BN的分析方法主要有高效液相色谱分析法和紫外分光光度法，前者从控制PH着手，对产品主成分进行测定，对碱性紫5BN粗制品和成品分析均适用，后者具有快速、方便、省时、准确等优点，可作为医院制剂质量控制的一种方法[2]。
4.实验部分
4.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪：Waters510泵； 484检测器；色谱工作站： Echr om 98 。
甲醇：色谱纯；蒸馏水：经 0 .45 μm滤膜过滤； 碱性紫5BN标准品；碱性紫5BN样品；分析天平 （感量： 0.01mg） ；定量环：10 μL；玻璃注射器： 0.25mL。
4.2 色谱分析条件
色谱柱： 150mm ×416mm i1d （Spherisorb C18） ；流动相：甲醇 +水 = 70 + 30 ；
流速： 0.8mL /min；波长： 280nm；进样量： 10μL。
4.3 标准品及样品的制备
4.3.1 标准溶液的配制
准确称取碱性紫 5BN标准品0.0095g ， 碱性紫6BN 标准品0.0106g ，分别用少量流动相溶解，并定容于50mL 容量瓶中，于超声波发生器中震荡10 min 后冷却至室温，配制成0.190mg/ mL 、0.212mg/ mL的标准溶液。
4.3.2 样品溶液的配制
用十万分之一的分析天平称量碱性紫5BN样品 0.00461g ，用少量流动相溶解并定容于100mL的容量瓶中， 于超声波发生器中震荡10 min 后冷却至室温，用0.45 μm 孔径滤膜过滤，配制成0.0461mg/ mL 的样品溶液，冷藏备用。
4.4 测定步骤
待仪器基线稳定后，连续注入数针标样溶液，直至相邻两面积相对变化均小于1.5%后，按标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。开机预热 ，仪器运行稳定后 ，用微量注射器分别吸取标准溶液和样品溶液依次注入并充满进样阀 ，待最后一个组分流出完毕 ，用数据处理机进行结果处理。
4.5 结果与讨论
4.5.1 检测波长的选择
碱性紫5BN和碱性紫6BN具有较大的共轭体系[3]，在可见区具有强烈的光吸收，碱性紫5BN 的最大吸收波长是580nm ，碱性紫6BN的最大吸收波长是557nm ，本文选用580nm为检测波长。
4.5.2 pH 值的选择
流动相pH 值的大小对碱性紫5BN和碱性紫6BN的保留时间、分离度有较大的影响。当pH 值小于5.5 时，碱性紫5BN和碱性紫6BN色谱峰重叠；pH 值大于5. 5 时，随着pH 值增大分离度逐渐改善，碱性紫5BN的保留时间也逐渐增加。为了缩短分离时间，同时又不至于使过强的碱性对色谱柱造成不利影響，选择pH 值为6.0较为合适。
4.5.3流动相的选择
用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法，即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法，即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加[4]。本试验采用梯度洗脱法，选择流动相溶解样品，碱性紫5BN不与流动相发生反应，对比样品与标样波长扫描图，对应的碱性紫5BN与碱性紫6BN完全一致。通过比较实验， 发现采用Spherisorb C18 色谱柱，以甲醇∶水= 7∶3为流动相 ，此时碱性紫5BN和碱性紫6BN及其它杂质得到很好的分离。
4.5.4 标准曲线的制作
以进样量（mg） 为横坐标（ x ） ， 峰面积为纵坐标（ y） ，作碱性紫6BN和碱性紫6BN标准曲线，结果分别为y =7988.1x - 5483.3（线性范围19.0～1140），y =6897.4x - 29522.5（线性范围21.2～1060） 。相关系数为0.9998和0.9997，可见， 碱性紫6BN和碱性紫6BN 的线性关系良好，线性范围较宽。
4.5.5 样品的含量及精密度
将配制好的0. 0461mg/ mL 的样品溶液在4.2的条件下进样20μL ，重复6 次，测定峰面积。碱性紫5BN峰面积平均值是7599250 ， 碱性紫6BN峰面积的平均值是405210 ，将峰面积分别代入表2 中各自的标准工作曲线方程， 求得碱性紫 5BN为85715mg ， 碱性紫6BN为58.1mg ，计算出各自的质量分数。碱性紫5BN % =857.5mg/（0.0461mg/ mL ×1000 ×20μL）= 93.0 %，同理求得碱性紫6BN质量分数是6.3 %。
通过峰面积的六次测定值求得碱性紫5BN 的变异系数是0.97 % ， 碱性紫6BN的变异系数是1.31 % ，由以上变异系数的数值说明，本方法重现性良好。
4.5.6 回收率的测定
在工业品碱性紫5BN的样品溶液中分别加入三种不同量的碱性紫5BN和碱性紫6BN的标准品。测定峰面积，取其算术平均值，并减去工业品碱性紫5BN样品中原有的碱性紫5BN和碱性紫6BN的峰面积，计算新增加的碱性紫5BN和碱性紫6BN的含量，然后计算出其回收率分别为99.6%和100.8%。
实验结果表明，分析试样中加入不同量的标准样品后，计算值与测定值基本相符，平均回收率接近于100% ，说明本方法准确度高，可靠性强。
4.5.7 检出限的测定
本文采用逐渐稀释的方法，以二倍信噪比计算检出限。碱性紫5BN的检出限是0.76mg，碱性紫6BN的检出限是0.27mg。
4.5.8 结论
采用高效液相色谱法 ，色谱条件：甲醇 +水 = 70+ 30 （ pH = 5.5～6.0）为流动相在C18柱上分析碱性紫5BN 、碱性紫6BN都能得到很好的分离。可以一次完成对碱性紫5BN及所含主要有机杂质的定量测试 ，适用于工业生产的质量控制 ，并对生产有一定的指导意义。
5.总结
本文提出的碱性紫5BN的高效液相色谱分析法，有较高的精密度和准确度，且操作简便 ，分析时间较短 ，是企业工业化生产时进行产品检验较为理想的分析方法。
参考文献
[1] 高林柏.生产碱性紫的非酚新工艺[J].江苏省扬州染料化工.2001，（04）：64.
[2]陈金全，荣林.紫外分光光度法测定甲紫溶液含量[J].《山东医药工业》，2003（03）：17-19.
[3]李春秋，朱殿奎，吴俊明.湿法合成红光碱性紫（5BN）染料[J].杨州师范学院：17-18.
[4]邹汗法，张玉奎，卢佩章.高效液相色谱法[M].科学出版社，2001.
蔡秀丽（1986---），女 ，江西龙南人，大学本科，应用化学专业，作者研究方向：环境保护