【摘 要】
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目的对表皮生长因子受体Ⅲ(epithelial growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)突变蛋白进行生物信息学分析,并构建表达该突变蛋白的HEK293T细胞系。方法根据NCBI公布的E
【基金项目】
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国家自然科学基金(81360344);甘肃省人民医院院内科研基金项目(16GSSY4-4)
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目的对表皮生长因子受体Ⅲ(epithelial growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)突变蛋白进行生物信息学分析,并构建表达该突变蛋白的HEK293T细胞系。方法根据NCBI公布的EGFR外显子序列,拼接成EGFRvⅢ编码基因,运用Protparam、ProtScale、SignalP 4. 1 Server、TMHMM Server v. 2. 0、SOPMA、SWISS-MODEL和SMART软件对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。设计融合PCR引物,克隆EGFRvⅢ基因,并连接到真核表达载体pEGFP-N1上,转染HEK293T细胞,Western blot法检测EGFRvⅢ-EGFP的表达。结果 EGFRvⅢ蛋白含943个氨基酸,预测相对分子质量约为104 335;理论等电点为6. 22;平均亲水性系数为-0. 306,亲水性氨基酸占63. 6%,疏水性氨基酸占36. 4%。EGFRvⅢ蛋白N-端1～24个氨基酸序列为信号肽序列,是一个细胞质膜定位的单次跨膜蛋白。二级结构预测显示,EGFRvⅢ蛋白主要由α螺旋和无规则卷曲组成,三级结构预测与二级结构预测结果一致。结构域预测显示,胞内酪氨酸激酶结构域完整,胞外受体结构域受损。融合PCR克隆出EGFRvⅢ编码基因,并在HEK293T细胞中表达出目的蛋白EGFRvⅢ-EGFP。结论成功获得表达EGFRvⅢ蛋白的HEK293T细胞系,为开展肿瘤浸润淋巴细胞免疫治疗或T细胞受体的研究奠定了基础。
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