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【摘要】目的对头孢拉定胶囊微生物限度检查法的验证分析。方法采用几类菌种对头孢拉定胶囊做微生物限度检查法的比较以及验证实验，并对验证实验结果进行回顾性分析。结果用薄膜过滤法进行头孢拉定胶囊的细菌计数，所污染的三株验证用细菌回收率均在70%以上；采用平皿法进行头孢拉定胶囊真菌计数，两株验证用真菌的回收率也均在70%以上。结论头孢拉定胶囊微生物限度检查法的验证中，分别采取薄膜过滤法测定细菌计数结果，平皿法测定真菌计数，表明以上方法的可行性与有效性。
【关键词】头孢拉定胶囊；微生物限度检查；验证
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.693文章编号：1004-7484（2014）-05-2943-02微生物限度检查法主要是指检查非规定灭菌制剂、原料、辅料受微生物污染程度的一种方法，该检查法的检查项目包括对霉菌数、细菌数、酵母菌数和控制菌等指标的检查[1]。本文就以头孢拉定胶囊作为研究对象，分析微生物限度检查法的应用，并作如下报道。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种应用中国药品生物制品检定所提供的菌种，包括有白色念珠菌[CMCC（F）9801]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、黑曲霉[CMCC（F）98003]五类菌种。
1.1.2培养基及试剂试验所用培养基包括有改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、MUG培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基等。试剂选择为分析纯氯化钠试剂。
1.1.3药品样品药品样品选择头孢拉定胶囊，规格：0.25g，批号：1201132。
1.1.4试验仪器本次试验主要的仪器设备包括有Htysteritest601智能集菌仪、TG16-WS台式高速离心机、PL1501-S电子分析天平、LRH-250-II生化培养箱，SPX-150生化培养箱，GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱。
1.2方法
1.2.1制备供试液10g供试品+100ml分析纯氯化钠试剂，在45-50℃水浴中充分浸泡、溶化，制成配比为1：10的供试液。
1.2.2制备菌液将各种菌种，制成每1ml含菌数50-80cfu的菌悬液。
1.2.3验证方法选择头孢拉定胶囊对细菌生长有较强的抑制作用，且药典所规定的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及枯草芽孢菌对本药品均比较敏感，因此本研究决定采用薄膜过滤法进行头孢拉定的细菌数测定。但本品对真菌没有明显的抑制作用，所以对黑曲霉、白色念珠菌等采用平皿法进行计数。
1.2.4细菌计数方法的验证采用薄膜过滤法，将取10ml1：10供试液置入离心机中离心5min后，取其上清液置入另一离心管中，加入PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml。①试验组：将滤膜以少量稀释剂浸湿，再取经上述离心方法制备的供试液1ml，加于100mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，并以500mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，分冲洗三次之后，将制备的大肠埃希菌菌悬液1ml加入冲洗液内过滤。再后，将冲洗后的滤膜菌取出，菌面朝上放置，贴在含2mlβ内酰胺酶营养琼脂培养基平板上，于35℃左右的温度连续培养48h计数。同样方法，再对枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌进行验证操作。②菌液组。取大肠埃菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌三种菌稀释而成的菌悬液各1ml，应用平皿菌落计数法，测定试验菌数。③供试品对照组。取供试液加入量测定供试品本底菌数，作为供试品对照组[2-3]。[回收率计算方法为：回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100%]。
1.2.5酵母菌及霉菌计数方法的验证采用平皿法对酵母菌和霉菌进行计数方法验证。①试验组：分别于4个平皿当中，加入1：10的供试液各1ml，再在2个平皿中加入黑曲霉菌、2个平皿中加入白色念珠菌。之后，立刻将玫瑰红钠琼脂培养基倾注其中，在25-28℃温度下连续培养72h。②菌液组。将上述两种菌稀释而成的菌悬液各取1ml，分别注入平皿中，每个菌平行制备两个平皿，并立即将玫瑰红钠琼脂培养基倾注其中，以测定所加的试验菌数。③供试品对照组：取供试液加入量测定供试品本底菌数，以其作为供试品对照组（注：上述1.2.4、1.2.5题中的方法均独立平行试验3次）。
2结果
本次研究中，采用薄膜过滤法，冲洗量为500ml进行头孢拉定胶囊的细菌计数，通过试验观察发现，3次独立平行试验中，所污染的大肠埃菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌三株验证用菌的回收率均在70%以上，表明本法测定细菌计数结果的有效性。而采用平皿法进行头孢拉定胶囊真菌计数，在3次平行试验中，黑曲霉菌及白色念珠菌两株验证用菌的回收率也均在70%以上，表示该法对真菌计数的可行性。微生物限度检查法的详细试验，见表1。
其一，本品对细菌生长可起到抑制作用，因此对本品验证最好采用薄膜过滤法；其二，在试验中，由于本品辅料容易引起滤膜阻塞，因此需先进行离心操作，去除辅料，再取上清液冲洗稀释后，才能保证本品通过滤膜的顺利性；其三，制备含β-内酰胺酶营养琼脂平板时，必须严格控制好温度，以保证实验的有效性；其四，由于本品采取一般薄膜过滤法仍很难除去头孢拉定的抑菌活性成分，因此在试验中均采取添加β-内酰胺酶加入胆盐乳糖增菌培养基中的方法，以保证三株验证菌的回收率。但本品对真菌并无抑制作用，因此可采用平皿法来测定真菌。
参考文献
[1]莫小林，伍小燕，韦振源，陈晓明，韦涛.10种中药制剂微生物限度检查方法学的验证[J].2013，18（13）：17.
[2]王偉娜，王涛.甲硝唑栓微生物限度检查方法学验证[J].医药导报，2011，30（11）：126-127.
[3]谢委，马永贵，张光勋，谢斌，王文清，施春阳.阿托伐他汀钙片微生物限度检查方法学验证[J].中国药师，2013，3（3）：1143-1144.
【关键词】头孢拉定胶囊；微生物限度检查；验证
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.693文章编号：1004-7484（2014）-05-2943-02微生物限度检查法主要是指检查非规定灭菌制剂、原料、辅料受微生物污染程度的一种方法，该检查法的检查项目包括对霉菌数、细菌数、酵母菌数和控制菌等指标的检查[1]。本文就以头孢拉定胶囊作为研究对象，分析微生物限度检查法的应用，并作如下报道。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种应用中国药品生物制品检定所提供的菌种，包括有白色念珠菌[CMCC（F）9801]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、黑曲霉[CMCC（F）98003]五类菌种。
1.1.2培养基及试剂试验所用培养基包括有改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、MUG培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基等。试剂选择为分析纯氯化钠试剂。
1.1.3药品样品药品样品选择头孢拉定胶囊，规格：0.25g，批号：1201132。
1.1.4试验仪器本次试验主要的仪器设备包括有Htysteritest601智能集菌仪、TG16-WS台式高速离心机、PL1501-S电子分析天平、LRH-250-II生化培养箱，SPX-150生化培养箱，GZX-9140MBE电热恒温鼓风干燥箱。
1.2方法
1.2.1制备供试液10g供试品+100ml分析纯氯化钠试剂，在45-50℃水浴中充分浸泡、溶化，制成配比为1：10的供试液。
1.2.2制备菌液将各种菌种，制成每1ml含菌数50-80cfu的菌悬液。
1.2.3验证方法选择头孢拉定胶囊对细菌生长有较强的抑制作用，且药典所规定的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以及枯草芽孢菌对本药品均比较敏感，因此本研究决定采用薄膜过滤法进行头孢拉定的细菌数测定。但本品对真菌没有明显的抑制作用，所以对黑曲霉、白色念珠菌等采用平皿法进行计数。
1.2.4细菌计数方法的验证采用薄膜过滤法，将取10ml1：10供试液置入离心机中离心5min后，取其上清液置入另一离心管中，加入PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml。①试验组：将滤膜以少量稀释剂浸湿，再取经上述离心方法制备的供试液1ml，加于100mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液过滤，并以500mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，分冲洗三次之后，将制备的大肠埃希菌菌悬液1ml加入冲洗液内过滤。再后，将冲洗后的滤膜菌取出，菌面朝上放置，贴在含2mlβ内酰胺酶营养琼脂培养基平板上，于35℃左右的温度连续培养48h计数。同样方法，再对枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌进行验证操作。②菌液组。取大肠埃菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌三种菌稀释而成的菌悬液各1ml，应用平皿菌落计数法，测定试验菌数。③供试品对照组。取供试液加入量测定供试品本底菌数，作为供试品对照组[2-3]。[回收率计算方法为：回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100%]。
1.2.5酵母菌及霉菌计数方法的验证采用平皿法对酵母菌和霉菌进行计数方法验证。①试验组：分别于4个平皿当中，加入1：10的供试液各1ml，再在2个平皿中加入黑曲霉菌、2个平皿中加入白色念珠菌。之后，立刻将玫瑰红钠琼脂培养基倾注其中，在25-28℃温度下连续培养72h。②菌液组。将上述两种菌稀释而成的菌悬液各取1ml，分别注入平皿中，每个菌平行制备两个平皿，并立即将玫瑰红钠琼脂培养基倾注其中，以测定所加的试验菌数。③供试品对照组：取供试液加入量测定供试品本底菌数，以其作为供试品对照组（注：上述1.2.4、1.2.5题中的方法均独立平行试验3次）。
2结果
本次研究中，采用薄膜过滤法，冲洗量为500ml进行头孢拉定胶囊的细菌计数，通过试验观察发现，3次独立平行试验中，所污染的大肠埃菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌三株验证用菌的回收率均在70%以上，表明本法测定细菌计数结果的有效性。而采用平皿法进行头孢拉定胶囊真菌计数，在3次平行试验中，黑曲霉菌及白色念珠菌两株验证用菌的回收率也均在70%以上，表示该法对真菌计数的可行性。微生物限度检查法的详细试验，见表1。
其一，本品对细菌生长可起到抑制作用，因此对本品验证最好采用薄膜过滤法；其二，在试验中，由于本品辅料容易引起滤膜阻塞，因此需先进行离心操作，去除辅料，再取上清液冲洗稀释后，才能保证本品通过滤膜的顺利性；其三，制备含β-内酰胺酶营养琼脂平板时，必须严格控制好温度，以保证实验的有效性；其四，由于本品采取一般薄膜过滤法仍很难除去头孢拉定的抑菌活性成分，因此在试验中均采取添加β-内酰胺酶加入胆盐乳糖增菌培养基中的方法，以保证三株验证菌的回收率。但本品对真菌并无抑制作用，因此可采用平皿法来测定真菌。
参考文献
[1]莫小林，伍小燕，韦振源，陈晓明，韦涛.10种中药制剂微生物限度检查方法学的验证[J].2013，18（13）：17.
[2]王偉娜，王涛.甲硝唑栓微生物限度检查方法学验证[J].医药导报，2011，30（11）：126-127.
[3]谢委，马永贵，张光勋，谢斌，王文清，施春阳.阿托伐他汀钙片微生物限度检查方法学验证[J].中国药师，2013，3（3）：1143-1144.