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摘要 [目的]筛选出提高双单倍体成活率的适宜器皿。[方法]采用一个育种材料的玉米单倍体籽粒，使用0.06% 秋水仙素溶液浸泡幼芽全部，移栽入无纺布育苗袋、穴盘、剪破的一次性纸杯3种不同的器皿中，研究3种器皿对玉米双单倍体生根及成活率的影响。[结果]3 种器皿对玉米双单倍体的生根及成活率的影响差异很大，以无纺布育苗袋移栽的双单倍体的根外露率及成活率均为最高。[结论]无纺布育苗袋是一种理想的移栽双单倍体器皿。
关键词 玉米；单倍体；秋水仙素；器皿；双单倍体
中图分类号 S513 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2015）05-039-02
Impact of Different Containers to Rooting and Survival Rate in Maize Double Haploid
ZHU XiangFen1， WANG ChangJiu2， LIU ChuanBing1， WANG LiMing1* et al
（1.Enshi Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences，Enshi，Hubei 445000； 2.Enshi Xianfeng County Agricultural Bureau，Xianfeng，Hubei 445600）
Abstract [Objective] In order to select suitable vessel for improving the survival rate of DH system.[Method] The buds of maize were soaked with 0.06% colchicine treatment.The effects of rooting rate and survival rate were studied.[Result] The results indicated that there had difference of rooting rate and the survival rate of the double haploids in the three containers.[Conclusion] The nonwoven biodegradable bags was the best during three containers for planting the double haploids.
Key words Maize； Haploid； Colchicines； Container；Double haploid
作者简介 朱祥芬（1985- ），女，湖北恩施人，助理农艺师，硕士，从事玉米栽培与育种研究。*通讯作者，高级农艺师，从事玉米栽培与育种研究。
收稿日期 20141226
玉米能为人体提供丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素、纤维素等营养物质[1]。由于玉米遗传基础较为复杂，变异种类丰富，选育优良玉米新品种是一个长期复杂的过程，主要体现在优良自交系的获得、高配合力自交系的组配及后期新品种的试验与鉴别等工序非常复杂耗时。仅通过传统的育种手段选育优良自交系，具有选择时间长、难以纯合等缺点[2]。单倍体育种技术可在一定程度上克服传统育种方法存在的不足，缩短产生纯合品系的时间[3-6]。目前，玉米单倍体育种中，单倍体的获得主要基于孤雌生殖诱导系诱导基础材料F1产生单倍体[7]，再经单倍体加倍获得双单倍体（double haploid），进而繁殖后代产生双单倍体[8]。单倍体的获得及加倍成双单倍体是双单倍体育种的基本环节。研究表明，双单倍体的获得一般采用自然加倍或药剂加倍，自然加倍率比较低，有些基因型材料甚至不发生自然加倍[9-10]，因此通过人工添加药剂提高单倍体加倍率是重要的途径之一，主要采用的加倍药剂为秋水仙素[11]，但是通过药剂处理后的双单倍体成活率低成为新的难题。目前关于提高玉米双单倍体成活率的研究较少。该研究将秋水仙素处理后的双单倍体移栽入不同的器皿中，在室内经过过渡性培养后再移栽至大田，比较不同器皿对提高双单倍体成活率的作用，筛选出提高双单倍体成活率的适宜器皿。
1 材料与方法
1.1 单倍体的诱导 该试验在海南陵水恩施州农业科学院南繁基地进行，选用综合表现优良的亲本组配的F1代为基础材料，采用中国农业大学、华中农业大学育种专家选育的诱导率较高的诱导系对F1代基础材料进行诱导，收获后根据母本籽粒的颜色标记进行人工挑选出单倍体籽粒（ 胚乳顶端紫色，胚无色），为确保单倍体的质量，进行二次挑选。
1.2 单倍体加倍 利用沙培法培养单倍体幼苗（需在 28 ℃左右的培养箱中暗光培养），待苗高达到2 cm左右时，清洗掉细沙，剪去单倍体芽顶端1～2 mm，将其浸泡在0.06%秋水仙碱+2%二甲基亚砜处理液中8 h（此步驟需在遮光条件下进行），流水洗涤4 h，获得双单倍体。
1.3 双单倍体室内移栽 将处理好的双单倍体苗分别移栽入无纺布育苗袋（6 cm×8 cm）、一次性纸杯及穴盘3种器皿中，在这3种器皿中均装入1/2基质与细土混合物。无纺布育苗袋由桐城市旭日塑业有限责任公司生产，可降解，是塑料育苗容器袋和塑料营养钵的升级换代产品。一次性纸杯为市场上销售的普通纸杯，将杯壁和杯底剪破。穴盘从淇航园艺公司购买（72孔）。在室内培养直至幼苗长至三叶一心时调查室内成活率、根外露率，然后移栽入大田，穴盘中的苗为带土移栽，无纺布育苗袋和一次性纸杯均随幼苗移栽而埋入大田，在此期间观察不同器皿移栽苗的生长情况，根据双单倍体的生长情况去杂株，并计算双单倍体在大田中的成活率。 2 结果与分析
研究3种器皿对加倍双单倍体成活率的影响得知，双单倍体在室内的成活率、根外露率及大田成活率均以无纺布育苗袋为移栽器皿的最高，分别为92.66%，90.96%，91.61%，其次是以穴盘为移栽器皿的效果，双单倍体成活率、根外露率及大田成活率分别为86.87%，80.83%，83.85%，一次性纸杯的效果最差，在此培养皿中双单倍体成活率、根外露率及大田成活率分别为63.32%，35.40%，37.96%。获得该结果可能与无纺布育苗袋具有良好的融水性、融土性和透气性有关，这些特点能使幼苗的根系在无阻力的条件下顺利生长及吸收外界养分，同时利用该器皿培育的幼苗移栽时不需要去袋，可直接定植，减少对幼苗的折腾，从而提高其成活率，无纺布育苗袋与土壤接触后，易降解，还具有省工省时、减少土壤污染的作用（表1，图1）。
注：a.穴盘中的双单倍体生长情况； b.无纺布育苗袋中的双单倍体生长情况； c.一次性纸杯中的双单倍体生长情况； d.穴盘中双单倍体的移栽情况； e.无纺布育苗袋双单倍体的移栽情况； f.一次性纸杯双单倍体的移栽情况。
图1 3种器皿中的双单倍体生长及移栽情况
3 结论与讨论
（1）单倍体育种技术只需2个世代便可得到纯合的双单倍体，极大缩短了育种周期，提高了育种效率。同时，双单倍体的利用能排除显性干扰，提高选择的准确性和保持亲本的纯合性，直接用于新品种的选育，可以减少育种盲目性，满足生产对各种品种类型的要求。目前，双单倍体多采用秋水仙素加倍获得，前人已做了很多相关研究。魏俊杰等[12]在玉米单倍体6叶期时进行秋水仙素注射处理，有效提高了玉米单倍体的加倍频率。段民孝等[13]采用秋水仙素浸泡幼芽上部和幼芽全部2种方式处理玉米单倍体，结果发现浸泡幼芽上部处理的玉米单倍体成活率比后者要高。利用秋水仙素处理玉米单倍体能提高加倍效率，但其具有很强的毒性，经其处理后的幼苗变得更脆弱，同时对大田条件的不适导致幼苗成活率受到很大影响[14]。
（2）该研究将受秋水仙素处理的双单倍体移栽在3种器皿中，使其在室内成活和生根，经过一个过渡期，然后转入大田环境下生长，调查双单倍体的成活情况。结果显示，利用无纺布育苗袋移栽的双单倍体能直接移入大田，避免二次折腾，在一定程度上提高了双单倍体的生根率及成活率，以穴盘为移栽器皿的双单倍体盘紧泥土，能保持生长所需的养分和水分，使得该处理的成活率较高，而以一次性纸杯为器皿移栽的双单倍体的根系外露及成活率最低，可能是由于一次性纸杯杯壁涂有防水的蜡层，不利于水分流通和玉米根系的穿透。
（3）通过分析得知，提高双单倍体成活率的途径有：①鉴于单倍体发芽率低、幼苗生长势弱的状况，进行沙培法培养单倍体时，需要培养较长时间，待单倍体完全发芽时再进行下一步处理，以避免真实单倍体因长势弱而遗弃；②利用秋水仙素处理单倍体幼苗时，应避免幼苗根系与秋水仙素溶液接触，减少幼苗根部对秋水仙素的吸收量，从而减轻药害；③移栽双单倍体时，应减少倒钵次数，尽可能让缓苗后的双单倍体在不倒钵的条件下直接移栽入大田。
参考文献
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[3] 江禹奉，程偉东，覃兰秋，等.单倍体技术在玉米育种上的应用[J].栽培育种[J/OL].http：//www.doc88.com/p9307125596694.html
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[9] 李璐，翁浩，赖钟雄.春石斛原球茎增殖与试管开花初步研究[M]//李健，连勇，徐涵.植物细胞和组织培养研究.北京： 中国科学技术出版社，2009： 133-140.
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[11] 黎亮，李浩川，徐小炜，等.玉米孤雌生殖单倍体加倍技术研究进展[J].玉米科学，2010，18（1）：12-14，19.
[12] 魏俊杰，张晓丽，陈梅香，等. 6叶期秋水仙素注射处理玉米单倍体的加倍效果研究[J].玉米科学，2007，15（4）：49-51.
[13] 段民孝，刘新香，赵久然，等.秋水仙素浸芽法处理玉米单倍体的加倍效果研究[J].种子，2013，32（2）：19-23.
[14] 彭尽晖， 张良波， 彭晓英. 秋水仙素在植物倍性育种中的应用进展[J].湖南林业科技，2004，31（5）：22-25.
责任编辑 高菲 责任校对 李岩
关键词 玉米；单倍体；秋水仙素；器皿；双单倍体
中图分类号 S513 文献标识码
A 文章编号 0517-6611（2015）05-039-02
Impact of Different Containers to Rooting and Survival Rate in Maize Double Haploid
ZHU XiangFen1， WANG ChangJiu2， LIU ChuanBing1， WANG LiMing1* et al
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Abstract [Objective] In order to select suitable vessel for improving the survival rate of DH system.[Method] The buds of maize were soaked with 0.06% colchicine treatment.The effects of rooting rate and survival rate were studied.[Result] The results indicated that there had difference of rooting rate and the survival rate of the double haploids in the three containers.[Conclusion] The nonwoven biodegradable bags was the best during three containers for planting the double haploids.
Key words Maize； Haploid； Colchicines； Container；Double haploid
作者简介 朱祥芬（1985- ），女，湖北恩施人，助理农艺师，硕士，从事玉米栽培与育种研究。*通讯作者，高级农艺师，从事玉米栽培与育种研究。
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玉米能为人体提供丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素、纤维素等营养物质[1]。由于玉米遗传基础较为复杂，变异种类丰富，选育优良玉米新品种是一个长期复杂的过程，主要体现在优良自交系的获得、高配合力自交系的组配及后期新品种的试验与鉴别等工序非常复杂耗时。仅通过传统的育种手段选育优良自交系，具有选择时间长、难以纯合等缺点[2]。单倍体育种技术可在一定程度上克服传统育种方法存在的不足，缩短产生纯合品系的时间[3-6]。目前，玉米单倍体育种中，单倍体的获得主要基于孤雌生殖诱导系诱导基础材料F1产生单倍体[7]，再经单倍体加倍获得双单倍体（double haploid），进而繁殖后代产生双单倍体[8]。单倍体的获得及加倍成双单倍体是双单倍体育种的基本环节。研究表明，双单倍体的获得一般采用自然加倍或药剂加倍，自然加倍率比较低，有些基因型材料甚至不发生自然加倍[9-10]，因此通过人工添加药剂提高单倍体加倍率是重要的途径之一，主要采用的加倍药剂为秋水仙素[11]，但是通过药剂处理后的双单倍体成活率低成为新的难题。目前关于提高玉米双单倍体成活率的研究较少。该研究将秋水仙素处理后的双单倍体移栽入不同的器皿中，在室内经过过渡性培养后再移栽至大田，比较不同器皿对提高双单倍体成活率的作用，筛选出提高双单倍体成活率的适宜器皿。
1 材料与方法
1.1 单倍体的诱导 该试验在海南陵水恩施州农业科学院南繁基地进行，选用综合表现优良的亲本组配的F1代为基础材料，采用中国农业大学、华中农业大学育种专家选育的诱导率较高的诱导系对F1代基础材料进行诱导，收获后根据母本籽粒的颜色标记进行人工挑选出单倍体籽粒（ 胚乳顶端紫色，胚无色），为确保单倍体的质量，进行二次挑选。
1.2 单倍体加倍 利用沙培法培养单倍体幼苗（需在 28 ℃左右的培养箱中暗光培养），待苗高达到2 cm左右时，清洗掉细沙，剪去单倍体芽顶端1～2 mm，将其浸泡在0.06%秋水仙碱+2%二甲基亚砜处理液中8 h（此步驟需在遮光条件下进行），流水洗涤4 h，获得双单倍体。
1.3 双单倍体室内移栽 将处理好的双单倍体苗分别移栽入无纺布育苗袋（6 cm×8 cm）、一次性纸杯及穴盘3种器皿中，在这3种器皿中均装入1/2基质与细土混合物。无纺布育苗袋由桐城市旭日塑业有限责任公司生产，可降解，是塑料育苗容器袋和塑料营养钵的升级换代产品。一次性纸杯为市场上销售的普通纸杯，将杯壁和杯底剪破。穴盘从淇航园艺公司购买（72孔）。在室内培养直至幼苗长至三叶一心时调查室内成活率、根外露率，然后移栽入大田，穴盘中的苗为带土移栽，无纺布育苗袋和一次性纸杯均随幼苗移栽而埋入大田，在此期间观察不同器皿移栽苗的生长情况，根据双单倍体的生长情况去杂株，并计算双单倍体在大田中的成活率。 2 结果与分析
研究3种器皿对加倍双单倍体成活率的影响得知，双单倍体在室内的成活率、根外露率及大田成活率均以无纺布育苗袋为移栽器皿的最高，分别为92.66%，90.96%，91.61%，其次是以穴盘为移栽器皿的效果，双单倍体成活率、根外露率及大田成活率分别为86.87%，80.83%，83.85%，一次性纸杯的效果最差，在此培养皿中双单倍体成活率、根外露率及大田成活率分别为63.32%，35.40%，37.96%。获得该结果可能与无纺布育苗袋具有良好的融水性、融土性和透气性有关，这些特点能使幼苗的根系在无阻力的条件下顺利生长及吸收外界养分，同时利用该器皿培育的幼苗移栽时不需要去袋，可直接定植，减少对幼苗的折腾，从而提高其成活率，无纺布育苗袋与土壤接触后，易降解，还具有省工省时、减少土壤污染的作用（表1，图1）。
注：a.穴盘中的双单倍体生长情况； b.无纺布育苗袋中的双单倍体生长情况； c.一次性纸杯中的双单倍体生长情况； d.穴盘中双单倍体的移栽情况； e.无纺布育苗袋双单倍体的移栽情况； f.一次性纸杯双单倍体的移栽情况。
图1 3种器皿中的双单倍体生长及移栽情况
3 结论与讨论
（1）单倍体育种技术只需2个世代便可得到纯合的双单倍体，极大缩短了育种周期，提高了育种效率。同时，双单倍体的利用能排除显性干扰，提高选择的准确性和保持亲本的纯合性，直接用于新品种的选育，可以减少育种盲目性，满足生产对各种品种类型的要求。目前，双单倍体多采用秋水仙素加倍获得，前人已做了很多相关研究。魏俊杰等[12]在玉米单倍体6叶期时进行秋水仙素注射处理，有效提高了玉米单倍体的加倍频率。段民孝等[13]采用秋水仙素浸泡幼芽上部和幼芽全部2种方式处理玉米单倍体，结果发现浸泡幼芽上部处理的玉米单倍体成活率比后者要高。利用秋水仙素处理玉米单倍体能提高加倍效率，但其具有很强的毒性，经其处理后的幼苗变得更脆弱，同时对大田条件的不适导致幼苗成活率受到很大影响[14]。
（2）该研究将受秋水仙素处理的双单倍体移栽在3种器皿中，使其在室内成活和生根，经过一个过渡期，然后转入大田环境下生长，调查双单倍体的成活情况。结果显示，利用无纺布育苗袋移栽的双单倍体能直接移入大田，避免二次折腾，在一定程度上提高了双单倍体的生根率及成活率，以穴盘为移栽器皿的双单倍体盘紧泥土，能保持生长所需的养分和水分，使得该处理的成活率较高，而以一次性纸杯为器皿移栽的双单倍体的根系外露及成活率最低，可能是由于一次性纸杯杯壁涂有防水的蜡层，不利于水分流通和玉米根系的穿透。
（3）通过分析得知，提高双单倍体成活率的途径有：①鉴于单倍体发芽率低、幼苗生长势弱的状况，进行沙培法培养单倍体时，需要培养较长时间，待单倍体完全发芽时再进行下一步处理，以避免真实单倍体因长势弱而遗弃；②利用秋水仙素处理单倍体幼苗时，应避免幼苗根系与秋水仙素溶液接触，减少幼苗根部对秋水仙素的吸收量，从而减轻药害；③移栽双单倍体时，应减少倒钵次数，尽可能让缓苗后的双单倍体在不倒钵的条件下直接移栽入大田。
参考文献
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责任编辑 高菲 责任校对 李岩