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【摘 要】 目的：优选升红颗粒提取纯化工艺的最佳条件。方法：处方中的鸡血藤和花生红衣用水提取，提取液浓缩后醇沉纯化。设计正交试验方法，以儿茶素、总黄酮含量为评价指标，对水提取工艺条件进行考察；以儿茶素、总黄酮转移率和浸膏得率为指标对醇沉纯化工艺条件进行考察。结果：水提取的最佳工艺条件为加水量为药材量的12倍，每次提取时间为1.5h，共提取3次；醇沉纯化的最佳工艺条件为浓缩液相对密度为1.10～1.15g/ml（30℃），含醇量为70%，静置时间36h。 结论：优选出的最佳工艺条件经验证其结果稳定，指标性成分含量高，可以用于投入生产。
【关键词】 升红颗粒；正交试验设计；儿茶素；总黄酮
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）07-0021-05
Abstract：Objectice To optimize the conditions of the extraction and purification technique for Shenghong granules. Methods Herb Caulis Spatholobi and peanut coat in formulation were extracted by water decocting，and the condensed extracted liquid was purified by ethanol precipitating. Taking the content of catechin and total flavonoids as evaluation markers for the extraction technique of water decocting，and the transferring rate of the catechin and total flavonoids，and extract yield as evaluation markers for the purification technique of ethanol precipitating，each technique condition was evaluated by orthogonal design. Results The optimum condition of water decocting process was that the crude herb powder were decocted for 3 times with 12-fold water，1.5 hour each time. The optimum condition of ethanol precipitating process was that extracted liquid was precipitated 36 hours，which relative density was 1.10～1.15g/ml（30℃）and concentration of ethanol was 70% . Conlusions The repeated experimental results are stable on the optimum conditions， and the contents of components for markers are high. which could be used for enlarged production.
Keywords：Shenghong granule； orthogonal design； catechin； total flavonoids
升红颗粒是根据我院肿瘤科临床验方开发的纯中药复方制剂，由鸡血藤、花生红衣、大枣、枸杞子等药材组成，用于治疗肿瘤患者化疗诱导的血小板减少症。研究证实，鸡血藤和花生红衣均含有具有刺激造血祖细胞增殖作用的儿茶素类成分[1-2]，而鸡血藤中的黄酮类成分也具有促进血虚动物模型造血功能的作用[3]。因此，在研究制剂工艺时以儿茶素含量和总黄酮含量作为考察提取纯工艺的指标。考虑到原方以水煎入药，且儿茶素和黄酮类成分在水、醇中的溶解性均较好，因此采用了传统的水提醇沉工艺路线，设计正交试验方法，对水煎煮提取和醇沉纯化两步骤的影响因素进行考察，对工艺条件进行优选，为升红颗粒制剂工艺的制定提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪；Libra S32 紫外分光光度计（英国 Biochrom）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；FA2004电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试药 儿茶素对照品（批号：110877-201203，中国食品药品检定研究院）；芦丁对照品（批号：100080-200707，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；鸡血藤（批号：140201，安徽井泉集团中药饮片有限公司）；花生红衣（批号：20130112，豪州成源中药饮片有限公司）。
2 方法与结果
2.1 高效液相色谱法测定儿茶素的含量[4]
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent HC-C18（4.6×250mm，5μm）；流动相为水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；检测波长280nm；流速0.8ml/min；柱温35℃。此条件下儿茶素色谱峰的保留时间为20.03min，理论塔板数为4169，分离度为19.03，拖尾因子为0.99。
2.1.2 标准曲线的制备 精密称定儿茶素对照品约10.0mg，置10ml容量瓶中，甲醇定容，配制成含量为0.98172mg/ml的对照品溶液。精密量取对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml分别置于10ml容量瓶中，甲醇定容，20μl进样测定，以进样量（X，μg）对色谱峰面积（Y）进行线性回归，回归方程为：Y=666049X-23116，相关系数r=0.9999，线性范围为0.098172～3.92688μg。 2.1.3 样品中儿茶素的含量测定 按正交试验设计各次实验规定的条件制备样品，精密量取规定体积的样品液，置蒸发皿中水浴蒸干，用流动相溶解，过滤后定容于25ml容量瓶，过0.45μm微孔滤膜后进样20μl测定峰面积，代入回归方程计算儿茶素的进样量，换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中儿茶素的含量。
2.2 络合-分光光度法测定总黄酮含量[5-6]
2.2.1 标准曲线的制备 精密称定芦丁对照品约10mg，用50%的乙醇定容于50ml容量瓶，制成对照品溶液（0.1830mg/ml）。精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置于25ml容量瓶中，各加50%乙醇使成5ml，再各加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，摇匀，放置6min，各加10%硝酸铝溶液2.0ml，摇匀，放置6min；再各加4.3%氢氧化钠试液10ml，分别用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min，制成待测对照品溶液。以第一瓶为空白对照，在510nm处测定各浓度对照品溶液吸光度，以吸光度（A）对浓度（C，mg/ml）进行线性回归，得回归方程C=0.0811A-0.0012（r=0.9995），线性范围为0.0183-0.0915mg/ml。
2.2.2 样品中总黄酮的含量测定 按正交实验设计各次实验规定的条件制备样品，精密吸取规定体积的样品液，置蒸发皿中水浴蒸干，用50%的乙醇溶解，过滤定容于100ml容量瓶中，精密量取0.0、1.0ml，分别置25ml容量瓶中，按照“2.2.1项”下的方法操作，过滤，取续滤液在510nm处测定吸光度，代入回归方程计算总黄酮的含量，换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中总黄酮的含量。
2.3 浸膏得率的测定 精密量取25ml样品溶液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，置于干燥器中冷却30min，迅速称重，换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中浸膏得率。
2.4 工艺条件筛选的正交实验设计
2.4.1 水煎煮提取工艺 以加水量（A，以药材量的倍数计算）、煎煮时间（B，以沸腾时开始计时）、煎煮次数（C）作为试验因素，每个因素备选了3个水平，详见表 1。
利用L9（34）正交表安排实验，按2倍处方量称取鸡血藤、花生红衣药材粗粉适量，按各次实验因素水平的要求进行水煎煮提取，过滤后合并，定容于1000ml容量瓶，精密量取样品液20ml，置蒸发皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”项下方法测定儿茶素和总黄酮含量。
2.4.2 醇沉工艺 水煎煮提取液中含有糖类、氨基酸、鞣质等水溶性杂质，造成收膏率高，影响后续的制剂成型和日服量，故考虑醇沉除杂。以浓缩液相对密度（D）、含醇量（E）、静置时间（F）作为实验因素，每个因素备选3个水平，条件见表2。
利用L9（34）正交表安排实验，按6倍处方量称取鸡血藤、花生红衣药材粗粉适量，以最佳水煎煮提取工艺提取后，过滤，合并滤液，浓缩成规定相对密度（30℃）的稠膏，精密称定重量。然后将稠膏分成四份，精密称定重量，其中一份用水稀释定容于100ml容量瓶，用于测定该次最佳水煎煮提取实验儿茶素和总黄酮的含量；另外三份精密测定体积，然后加乙醇至规定的含醇量，静置规定的时间，过滤，定容于100ml容量瓶，用于测定醇沉后的儿茶素、总黄酮含量和浸膏得率。儿茶素和总黄酮含量的测定：精密量取样品液5ml，置蒸发皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”项下方法测定。根据醇沉前后儿茶素、总黄酮含量的变化，计算醇沉后儿茶素、总黄酮的转移率。
醇沉后儿茶素转移率=醇沉后儿茶素的含量/该次水煎煮提取实验儿茶素含量×100%
醇沉后总黄酮转移率=醇沉后总黄酮的含量/该次水煎煮提取实验总黄酮含量×100%
2.5 实验结果及分析
2.5.1 水煎煮提取各次正交实验结果及方差分析 见表3、表4。
由表3可知，水煎煮提取实验各因素对儿茶素提取率的影响大小为C>B>A，最佳工艺条件为A1B3C3；对总黄酮提取率的影响大小为C>A>B，最佳工艺条件为A3B1C3。表4方差分析的结果表明，A、B两个因素对儿茶素、总黄酮提取率的影响无统计学意义，而C因素对儿茶素、总黄酮提取率的影响有统计学意义。由于水煎煮提取的目标主要是具有刺激造血祖细胞增殖作用的儿茶素，故以儿茶素含量权重为60%，总黄酮含量权重为40%进行加权综合评分，由综合评分的极差分析可知，各因素对综合评分的影响大小为C>B>A，最佳工艺条件为A3B3C3；方差分析表明A、B两因素对综合评分的影响无统计学意义，而C因素对综合评分的影响有统计学意义。因此选择水煎煮提取的最佳工艺条件为A3B3C3，即加水量为12倍，煎煮时间为1.5h，煎煮次数为3次。
按照最佳水煎煮提取工艺条件进行3次验证性实验，儿茶素平均含量为1.0204mg/g，总黄酮平均含量为77.9289mg/g，证明该工艺条件是稳定、可行的。
2.5.2 醇沉各次正交实验结果及方差分析 见表5、表6。
由表5可知，醇沉实验各因素对儿茶素转移率的影响大小为A>B>C，最佳工艺条件为A2B3C2；对总黄酮转移率的影响大小为B>C>A，最佳工艺条件为A2B3C3；对浸膏得率的影响大小为A>C>B，最佳工艺条件为A3B1C1。表6方差分析的结果表明，A、B、C三个因素对儿茶素的转移率的影响有统计学意义，而对总黄酮转移率、浸膏得率的影响没有统计学意义。由于醇沉的目标主要是在保留儿茶素、黄酮等有效成分的基础上除杂，故以儿茶素转移率权重为50%，总黄酮转移率权重为30%，浸膏得率权重为20%进行加权综合评分（由于浸膏得率与醇沉纯化效果成反比关系，故以浸膏得率倒数进行评分），由综合评分的极差分析可知，各因素对综合评分的影响大小为B>A>C，最佳工艺条件为A2B3C3；方差分析表明A、B、C三个因素对综合评分的影响均有统计学意义。因此选择醇沉的最佳工艺条件为A2B3C3，即浓缩液相对密度为1.10～1.15g/ml，含醇量为70%，静置时间为36h。按照最佳醇沉工艺条件进行3次验证性实验，儿茶素转移率平均为78.54%，总黄酮转移率平均为87.89%，浸膏得率平均为0.1471g/g，证明该工艺条件是稳定、可行的。 3 讨论
进行醇沉工艺研究时，将最佳水煎煮提取后的样品浓缩到规定的相对密度后进行醇沉，因此醇沉后的儿茶素、总黄酮的含量与醇沉前样品中的儿茶素、总黄酮含量直接相关。由于各次最佳水煎煮提取的样品中儿茶素、总黄酮的含量并不相同，最佳水煎煮提取的样品中儿茶素、总黄酮的含量偏高者，醇沉后儿茶素、总黄酮含量也会相应偏高，如果直接以醇沉后儿茶素、总黄酮的含量作为醇沉工艺条件的考查指标，可能带来较大的误差。因此，对最佳水煎煮提取的样品抽样测定其儿茶素、总黄酮的含量，再对醇沉后的样品测定儿茶素、总黄酮含量，根据醇沉前后儿茶素、总黄酮含量的变化，计算醇沉后儿茶素、总黄酮的转移率，作为考查醇沉工艺条件的指标，可以避免各次最佳水煎煮提取样品中儿茶素、总黄酮的含量不一致而带来的误差。
采用络合-分光光度法测定各次正交实验样品中总黄酮含量，其实验原理是黄酮类物质在碱性与亚硝酸根存在的环境下与铝离子形成稳定的红色络合物，但我们在制备供试品过程中发现有红色沉淀产生，造成测定结果不稳定。该现象与样品中原花色素类物质在碱性条件下形成沉淀，并与铝离子形成络合物有关[7]，因此根据文献采取了增加硝酸铝试液剂量，并过滤除去沉淀的办法，较好地解决了该问题。
参考文献
[1]刘屏，王东晓，陈桂芸，等.鸡血藤单体化合物对造血祖细胞增殖的调控作用研究[J].中国药理学通报，2007，23（6）：741-745.
[2]梁宁，韦松基，林启云.鸡血藤总黄酮对血虚小鼠抗贫血作用及机理研究[J].时珍国医国药，2009，20（2）：362-363.
[3]张秀尧，凌罗庆，戴荣兴.花生衣的化学成分研究[J].中国中药杂志，1990，15（6）：36-39.
[4]贾智若，李兵，李耀华，等.反相高效液相色谱法测定杜仲中儿茶素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：117-119.
[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：333.
[6]李江，黄忠仕，蒋伟哲，等.复方六月雪颗粒提取工艺研究[J].中国药房，2005，16（1）：16-19.
[7]曾凡骏，陈松波，曾里，等.一种改进的银杏黄酮紫外分光光度检测方法的研究[J].食品科学， 2003，24（11）：102-104.
（收稿日期：2015.01.12）
【关键词】 升红颗粒；正交试验设计；儿茶素；总黄酮
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2015）07-0021-05
Abstract：Objectice To optimize the conditions of the extraction and purification technique for Shenghong granules. Methods Herb Caulis Spatholobi and peanut coat in formulation were extracted by water decocting，and the condensed extracted liquid was purified by ethanol precipitating. Taking the content of catechin and total flavonoids as evaluation markers for the extraction technique of water decocting，and the transferring rate of the catechin and total flavonoids，and extract yield as evaluation markers for the purification technique of ethanol precipitating，each technique condition was evaluated by orthogonal design. Results The optimum condition of water decocting process was that the crude herb powder were decocted for 3 times with 12-fold water，1.5 hour each time. The optimum condition of ethanol precipitating process was that extracted liquid was precipitated 36 hours，which relative density was 1.10～1.15g/ml（30℃）and concentration of ethanol was 70% . Conlusions The repeated experimental results are stable on the optimum conditions， and the contents of components for markers are high. which could be used for enlarged production.
Keywords：Shenghong granule； orthogonal design； catechin； total flavonoids
升红颗粒是根据我院肿瘤科临床验方开发的纯中药复方制剂，由鸡血藤、花生红衣、大枣、枸杞子等药材组成，用于治疗肿瘤患者化疗诱导的血小板减少症。研究证实，鸡血藤和花生红衣均含有具有刺激造血祖细胞增殖作用的儿茶素类成分[1-2]，而鸡血藤中的黄酮类成分也具有促进血虚动物模型造血功能的作用[3]。因此，在研究制剂工艺时以儿茶素含量和总黄酮含量作为考察提取纯工艺的指标。考虑到原方以水煎入药，且儿茶素和黄酮类成分在水、醇中的溶解性均较好，因此采用了传统的水提醇沉工艺路线，设计正交试验方法，对水煎煮提取和醇沉纯化两步骤的影响因素进行考察，对工艺条件进行优选，为升红颗粒制剂工艺的制定提供科学依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪；Libra S32 紫外分光光度计（英国 Biochrom）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；FA2004电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2 试药 儿茶素对照品（批号：110877-201203，中国食品药品检定研究院）；芦丁对照品（批号：100080-200707，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；鸡血藤（批号：140201，安徽井泉集团中药饮片有限公司）；花生红衣（批号：20130112，豪州成源中药饮片有限公司）。
2 方法与结果
2.1 高效液相色谱法测定儿茶素的含量[4]
2.1.1 色谱条件 色谱柱为Agilent HC-C18（4.6×250mm，5μm）；流动相为水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；检测波长280nm；流速0.8ml/min；柱温35℃。此条件下儿茶素色谱峰的保留时间为20.03min，理论塔板数为4169，分离度为19.03，拖尾因子为0.99。
2.1.2 标准曲线的制备 精密称定儿茶素对照品约10.0mg，置10ml容量瓶中，甲醇定容，配制成含量为0.98172mg/ml的对照品溶液。精密量取对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml分别置于10ml容量瓶中，甲醇定容，20μl进样测定，以进样量（X，μg）对色谱峰面积（Y）进行线性回归，回归方程为：Y=666049X-23116，相关系数r=0.9999，线性范围为0.098172～3.92688μg。 2.1.3 样品中儿茶素的含量测定 按正交试验设计各次实验规定的条件制备样品，精密量取规定体积的样品液，置蒸发皿中水浴蒸干，用流动相溶解，过滤后定容于25ml容量瓶，过0.45μm微孔滤膜后进样20μl测定峰面积，代入回归方程计算儿茶素的进样量，换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中儿茶素的含量。
2.2 络合-分光光度法测定总黄酮含量[5-6]
2.2.1 标准曲线的制备 精密称定芦丁对照品约10mg，用50%的乙醇定容于50ml容量瓶，制成对照品溶液（0.1830mg/ml）。精密量取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分别置于25ml容量瓶中，各加50%乙醇使成5ml，再各加5%亚硝酸钠溶液1.0ml，摇匀，放置6min，各加10%硝酸铝溶液2.0ml，摇匀，放置6min；再各加4.3%氢氧化钠试液10ml，分别用50%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15min，制成待测对照品溶液。以第一瓶为空白对照，在510nm处测定各浓度对照品溶液吸光度，以吸光度（A）对浓度（C，mg/ml）进行线性回归，得回归方程C=0.0811A-0.0012（r=0.9995），线性范围为0.0183-0.0915mg/ml。
2.2.2 样品中总黄酮的含量测定 按正交实验设计各次实验规定的条件制备样品，精密吸取规定体积的样品液，置蒸发皿中水浴蒸干，用50%的乙醇溶解，过滤定容于100ml容量瓶中，精密量取0.0、1.0ml，分别置25ml容量瓶中，按照“2.2.1项”下的方法操作，过滤，取续滤液在510nm处测定吸光度，代入回归方程计算总黄酮的含量，换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中总黄酮的含量。
2.3 浸膏得率的测定 精密量取25ml样品溶液，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，置于干燥器中冷却30min，迅速称重，换算成鸡血藤和花生红衣药材总量中浸膏得率。
2.4 工艺条件筛选的正交实验设计
2.4.1 水煎煮提取工艺 以加水量（A，以药材量的倍数计算）、煎煮时间（B，以沸腾时开始计时）、煎煮次数（C）作为试验因素，每个因素备选了3个水平，详见表 1。
利用L9（34）正交表安排实验，按2倍处方量称取鸡血藤、花生红衣药材粗粉适量，按各次实验因素水平的要求进行水煎煮提取，过滤后合并，定容于1000ml容量瓶，精密量取样品液20ml，置蒸发皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”项下方法测定儿茶素和总黄酮含量。
2.4.2 醇沉工艺 水煎煮提取液中含有糖类、氨基酸、鞣质等水溶性杂质，造成收膏率高，影响后续的制剂成型和日服量，故考虑醇沉除杂。以浓缩液相对密度（D）、含醇量（E）、静置时间（F）作为实验因素，每个因素备选3个水平，条件见表2。
利用L9（34）正交表安排实验，按6倍处方量称取鸡血藤、花生红衣药材粗粉适量，以最佳水煎煮提取工艺提取后，过滤，合并滤液，浓缩成规定相对密度（30℃）的稠膏，精密称定重量。然后将稠膏分成四份，精密称定重量，其中一份用水稀释定容于100ml容量瓶，用于测定该次最佳水煎煮提取实验儿茶素和总黄酮的含量；另外三份精密测定体积，然后加乙醇至规定的含醇量，静置规定的时间，过滤，定容于100ml容量瓶，用于测定醇沉后的儿茶素、总黄酮含量和浸膏得率。儿茶素和总黄酮含量的测定：精密量取样品液5ml，置蒸发皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”项下方法测定。根据醇沉前后儿茶素、总黄酮含量的变化，计算醇沉后儿茶素、总黄酮的转移率。
醇沉后儿茶素转移率=醇沉后儿茶素的含量/该次水煎煮提取实验儿茶素含量×100%
醇沉后总黄酮转移率=醇沉后总黄酮的含量/该次水煎煮提取实验总黄酮含量×100%
2.5 实验结果及分析
2.5.1 水煎煮提取各次正交实验结果及方差分析 见表3、表4。
由表3可知，水煎煮提取实验各因素对儿茶素提取率的影响大小为C>B>A，最佳工艺条件为A1B3C3；对总黄酮提取率的影响大小为C>A>B，最佳工艺条件为A3B1C3。表4方差分析的结果表明，A、B两个因素对儿茶素、总黄酮提取率的影响无统计学意义，而C因素对儿茶素、总黄酮提取率的影响有统计学意义。由于水煎煮提取的目标主要是具有刺激造血祖细胞增殖作用的儿茶素，故以儿茶素含量权重为60%，总黄酮含量权重为40%进行加权综合评分，由综合评分的极差分析可知，各因素对综合评分的影响大小为C>B>A，最佳工艺条件为A3B3C3；方差分析表明A、B两因素对综合评分的影响无统计学意义，而C因素对综合评分的影响有统计学意义。因此选择水煎煮提取的最佳工艺条件为A3B3C3，即加水量为12倍，煎煮时间为1.5h，煎煮次数为3次。
按照最佳水煎煮提取工艺条件进行3次验证性实验，儿茶素平均含量为1.0204mg/g，总黄酮平均含量为77.9289mg/g，证明该工艺条件是稳定、可行的。
2.5.2 醇沉各次正交实验结果及方差分析 见表5、表6。
由表5可知，醇沉实验各因素对儿茶素转移率的影响大小为A>B>C，最佳工艺条件为A2B3C2；对总黄酮转移率的影响大小为B>C>A，最佳工艺条件为A2B3C3；对浸膏得率的影响大小为A>C>B，最佳工艺条件为A3B1C1。表6方差分析的结果表明，A、B、C三个因素对儿茶素的转移率的影响有统计学意义，而对总黄酮转移率、浸膏得率的影响没有统计学意义。由于醇沉的目标主要是在保留儿茶素、黄酮等有效成分的基础上除杂，故以儿茶素转移率权重为50%，总黄酮转移率权重为30%，浸膏得率权重为20%进行加权综合评分（由于浸膏得率与醇沉纯化效果成反比关系，故以浸膏得率倒数进行评分），由综合评分的极差分析可知，各因素对综合评分的影响大小为B>A>C，最佳工艺条件为A2B3C3；方差分析表明A、B、C三个因素对综合评分的影响均有统计学意义。因此选择醇沉的最佳工艺条件为A2B3C3，即浓缩液相对密度为1.10～1.15g/ml，含醇量为70%，静置时间为36h。按照最佳醇沉工艺条件进行3次验证性实验，儿茶素转移率平均为78.54%，总黄酮转移率平均为87.89%，浸膏得率平均为0.1471g/g，证明该工艺条件是稳定、可行的。 3 讨论
进行醇沉工艺研究时，将最佳水煎煮提取后的样品浓缩到规定的相对密度后进行醇沉，因此醇沉后的儿茶素、总黄酮的含量与醇沉前样品中的儿茶素、总黄酮含量直接相关。由于各次最佳水煎煮提取的样品中儿茶素、总黄酮的含量并不相同，最佳水煎煮提取的样品中儿茶素、总黄酮的含量偏高者，醇沉后儿茶素、总黄酮含量也会相应偏高，如果直接以醇沉后儿茶素、总黄酮的含量作为醇沉工艺条件的考查指标，可能带来较大的误差。因此，对最佳水煎煮提取的样品抽样测定其儿茶素、总黄酮的含量，再对醇沉后的样品测定儿茶素、总黄酮含量，根据醇沉前后儿茶素、总黄酮含量的变化，计算醇沉后儿茶素、总黄酮的转移率，作为考查醇沉工艺条件的指标，可以避免各次最佳水煎煮提取样品中儿茶素、总黄酮的含量不一致而带来的误差。
采用络合-分光光度法测定各次正交实验样品中总黄酮含量，其实验原理是黄酮类物质在碱性与亚硝酸根存在的环境下与铝离子形成稳定的红色络合物，但我们在制备供试品过程中发现有红色沉淀产生，造成测定结果不稳定。该现象与样品中原花色素类物质在碱性条件下形成沉淀，并与铝离子形成络合物有关[7]，因此根据文献采取了增加硝酸铝试液剂量，并过滤除去沉淀的办法，较好地解决了该问题。
参考文献
[1]刘屏，王东晓，陈桂芸，等.鸡血藤单体化合物对造血祖细胞增殖的调控作用研究[J].中国药理学通报，2007，23（6）：741-745.
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（收稿日期：2015.01.12）